Hepcidin在酒精性肝病发病中的作用研究进展

冀 杨 徐有青 王 晨

铁作为人体最丰富的必需微量元素之一，广泛参与体内各项生理活动，在红细胞生成、DNA合成及细胞呼吸中均起着重要的作用。但是过量的铁可催化过氧化物和超氧化物（O2-）成为氧化性更强的羟自由基（OH-）、高铁自由基或超高铁自由基，加重氧化应激及脂质过氧化反应，造成细胞损伤[1]。在正常情况下，机体严格调节铁的吸收和利用以保持体内铁稳态（iron homeostaisis）。铁调节蛋白（Hepcidin）就是这样一个由肝脏分泌，通过调节十二指肠、脾脏及骨髓中铁转运以维持铁稳态的铁调蛋白。在人体内，肝脏和网状内皮系统是铁储存的主要场所，肝脏铁沉积在很多肝脏疾病中普遍存在，而铁代谢紊乱在这些疾病发展中起着推波助澜的作用。酒精性肝病患者常伴有铁代谢相关蛋白表达异常，出现转铁蛋白饱和度和铁蛋白增高及肝脏铁沉积。酒精和铁呈协同作用加重肝脏损伤。目前研究认为酒精抑制铁调节蛋白在肝脏表达可能是酒精性肝病“二次打击”假说的一个发病机制。

一、酒精性肝病与铁沉积

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是指由于过量酒精摄入导致的肝脏损害及其一系列病变，包括轻症酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化[2]。早期研究发现酒精与机体铁代谢紊乱相关。肝细胞吸收铁的方式可分为转铁蛋白（transferrin，Tf）和非转铁蛋白途径。大部分血清铁首先与Tf结合，再通过转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）被肝细胞吸收。而非结合铁（non-Tf-bound iron，NTBI）的吸收则通过二价金属离子转运蛋白（divalent metal transporter，DMT1）。肝细胞膜上有两种转铁蛋白受体（TfR），TfR1和TfR2。TfR2介导的铁摄取是肝细胞获得铁的主要途径。在正常肝脏细胞中TfR2呈稳定表达，而TfR1生成则受到抑制。Suzuki观察到ALD患者肝脏组织中TfR1表达增加了80%，而正常组织中则没有变化[3]。体外实验也发现酒精和铁处理后的大鼠肝脏细胞中TfR1表达显著增加[4]，从而证实酒精可以影响TfR1表达和铁吸收。临床上有超过30%的ALD患者表现为血清铁蛋白和转铁蛋白饱和度增高，肝脏内出现铁的过度沉积[5]。在ALD早期阶段仅在肝脏细胞内出现轻微的铁沉积，当发展到酒精性肝硬化晚期，肝脏细胞及巨噬细胞中均会出现显著的铁沉积。同样在ALD患者中还发现小肠及肝脏铁摄取率较普通人增加[6，7]。酒精性肝硬化患者的血清铁蛋白含量增高，其死亡率与肝脏铁含量及铁蛋白有关[8]。美国一项大规模人群调查也发现轻或中度饮酒即可提高铁沉积的风险，而大量摄入酒精（每日饮用酒精饮品超过2瓶）后该作用更加明显[9]。铁沉积同样存在于ALD动物模型[10]。但也有研究发现长期酗酒可致患者贫血和缺铁，究其原因为饮食减少、消化吸收障碍或者胃肠道出血所致，向酗酒者提供全面和充分的营养后则不会发生，同时在营养良好的酒精性肝病患者中也不存在贫血和缺铁情况[11]，均证明酒精本身不会引起铁缺乏。目前我国尚缺乏酒精性肝病的全国性大规模流行病学调查资料。

酒精在肝脏经过细胞色素P450酶、乙醇脱氢酶、过氧化物酶代谢后产生超氧阴离子和自由基，诱发氧化应激和脂质过氧化反应；铁作为一种强力催化剂，也能促进氧自由基的产生。当二者产生协同作用时，则加剧这一反应过程，造成肝脏损伤。肝脏中铁沉积程度与脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）和 4-羟基壬烯醛（4-Hydroxynonenal，4-HNE）水平呈正相关验证了此观点[12，13]。同时巨噬细胞中铁含量升高会引起转录因子如细胞核因子（nuclear factor-kappa，NF-κB）活性和促炎因子如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白介素 1（interleukin-1，IL-1）、白介素6（interleukin-6，IL-6）表达增加。这些脂质过氧化反应产物通过刺激肝细胞胶原的合成，促进肝纤维化，加速发展为肝硬化。另外，体内高铁环境对肿瘤还有诱发和促进作用。有报道称铁超载可引起肝细胞肿瘤。而口服铁螯合剂治疗可以减轻慢性酒精性肝病大鼠的脂质过氧化损伤。

二、铁代谢和铁调节蛋白

在正常情况下，食物中的三价铁首先在小肠粘膜上皮中的十二指肠细胞色素 b（duodenal cytochrome b，Dcytb）作用还原成二价铁，然后由二价金属离子转运蛋白（divalent metal transporter1，DMT1）转运进入肠上皮细胞。再经肠上皮细胞基底膜侧的膜铁转运蛋白（ferroportin1，FP1）和膜铁转运辅助蛋白（hephaestin，HP）作用将二价铁转运入血并氧化为三价，转铁蛋白（transferrin）可与之结合，通过血液运送到全身各处。骨髓是机体利用铁的主要部位，它通过网织红细胞转铁蛋白受体摄取铁后合成红细胞及血红素。网状内皮系统中的巨噬细胞通过吞噬衰老红细胞获取铁，亦可通过膜表面的TfR直接从循环系统中摄取铁，保证铁再循环。巨噬细胞中的铁可以在铜蓝蛋白作用下氧化后释放到血浆供其他组织利用，也可以储存在细胞内。在生理状态下机体缺乏铁排泄的机制，因此铁稳态的维持显得尤为重要。

研究发现近段小肠中存在一种称为十二指肠隐窝细胞（duodenal crypt cells）的小肠上皮前体细胞，它能够通过感受自身铁含量又称铁池（iron pool）变化调控铁调节蛋白（iron regulatory protein，IRPs）活性。当循环铁水平升高，隐窝细胞内铁池增大，抑制肠上皮细胞膜中DMT1和FP1等表达，减少铁吸收。反之，循环铁降低引起隐窝细胞内铁池变小，铁转运蛋白表达量升高，铁摄入量增加。但是铁代谢信号在小肠、肝脏、骨髓和巨噬细胞之间传递的机制还不清楚。因此，推测存在一种广泛分布体内的可溶性蛋白作为铁代谢调节信号的传递者。

2000年Krause等[14]从血液中分离到一个富含半胱氨酸的抗菌多肽，后被证明就是一种铁代谢调节激素，称为肝脏表达的抗菌多肽-1（liver-expressed antimicrobial peptide-1，LEAP-1）。2001年Park等人[15]从人尿中也分离到这一多肽，命名为 Hepcidin，或 HAMP（hepcidin antimicrobial peptide）。它是由一个富含精氨酸和赖氨酸的84个氨基酸多肽，经加工剪切后成为20、22和25个氨基酸三种成熟形式的多肽，其中以Hepcidin25生物活性最强。Hepcidin广泛存在于血液及其它体液并在肝脏特异性表达，心脏、肺及脊髓中也有少量表达，而其他脏器几乎没有表达。铁调节蛋白的结构在不同物种间高度保守。小鼠体内存在两个Hepcidin基因，分别为Hepcl和Hepc2。它们与人类Hepcidin基因的同源性达到76%和58%。人类的Hepcidin基因位于19号染色体上，它由3个外显子和2个内含子组成，其中第3个外显子编码了Hepcidin的氨基酸序列。其上游存在转录因子CAAT增强子结合蛋白（CAAT enhancer binding protein，C/EBP）、NF-κB和肝核因子（hepatic nuclear factor，HNF）等潜在转录因子调节结合位点以及TATA起始结合位点。肝脏中Hepcidin基因表达还受到其上游基因的调节，其中转铁蛋白受体2（TfR2）、遗传性血色素沉着病基因（Hfe）、青少年血色病基因（Hjv）起正向调节作用。最近新发现一种跨膜丝氨酸蛋白酶（TMPRSS6），它是第一个被证明对Hepcidin表达起着负向调节作用的因子。

Hepcidin主要通过抑制肠道铁吸收和单核巨噬细胞系统铁释放调控铁稳态，它在肝脏、小肠、网织红细胞和网状内皮系统之间传递铁调节信号[16]。高铁饮食、铁过载或炎症因子均引起肝脏Hepcidin表达增加[17]，贫血及缺氧则抑制其表达[18]。Niconlas等[19]发现在上游的刺激因子（upstream stimulatory factor 2，USF2）基因敲除的小鼠模型中出现严重铁过剩，症状与遗传性血色素沉着病极其相似。并随后证实铁过度沉积与USF2基因敲除小鼠不能表达下游的Hepcidin基因有关。而Hepcidin高表达的转基因小鼠在出生几小时后即死于严重的缺铁性贫血[20]。Nemeth的研究[21]发现，Hepcidin通过调控位于小肠基底外侧膜FPl的表达来调控铁的吸收。Hepcidin首先与肠上皮细胞膜中膜铁转运蛋白（FP1）结合，导致细胞膜上FPN1内吞进入细胞，最后在溶酶体降解。随后Ganz对Hepcidin调控铁代谢机制作了阐述。他认为在机体铁贮备过高时，肝脏合成Hepcidin量增加，高水平的Hepcidin与FP1结合后降解，而FP1是目前已知的在脊椎动物中唯一的铁输出蛋白通道，也就是阻断了铁从肠细胞转运到血浆，同时也将铁锁定在肠细胞、肝脏及巨噬细胞内，而富含铁的小肠细胞会在2天内脱落排出体外，阻止肠道摄入铁以及肝脏、巨噬细胞中铁的释放和再利用，从而降低循环铁量。

总之，Hepcidin对单核巨噬细胞系统铁储存起正向调控作用，而对肠道铁吸收起负向调控作用，并通过十二指肠肠细胞以及单核巨噬细胞参与机体铁稳态的调控。

三、酒精与铁调节蛋白

酒精不仅可以诱发氧化应激和脂质过氧化反应，还可以增加小肠中铁及内毒素的吸收，从而激活巨噬细胞产生释放炎症因子和活性氧。而铁、病毒感染、内毒素和自由基在酒精性肝病的病情进展中的作用无异于二次打击。同样，Hepcidin在肝脏中表达也受铁负荷、酒精、丙型肝炎病毒、炎症因子、缺氧和氧化应激的调节[17，18，22]。在遗传性血色素病患者中，尽管存在严重的肝脏铁沉积，但因其血清pro-hepcidin低于健康人，患者的铁吸收仍处于高水平。因此，推测Hepcidin下调就是酒精性肝病患者发生肝脏铁沉积的重要机制之一。

事实上，无论是在ALD动物模型还是ALD患者、体内实验还是体外实验、慢性饮酒还是急性酒精性肝损伤中，研究均发现酒精能够下调肝脏Hepcidin表达，继而引起十二指肠DMT1及FP表达增加[23，24]。慢性酒精摄入会引起大鼠肝脏中铁蛋白升高[25]。Ohtake等[24]观察到酒精性肝病患者血清pro-Hepcidin明显降低，酒精性肝病小鼠模型的肝脏hepcidin表达下降，均验证了这一点。此外，酒精并不改变转铁蛋白受体1（TfR-1）、铁蛋白的表达以及铁调节蛋白（IRP）的活性，说明酒精调节Hepcidin是作用于其本身而不是靠改变细胞内铁环境而发挥作用的[23]。Harrison-Findik等人[23]在研究小鼠急性酒精性肝损伤模型时发现乙醇可以减少hepcidin的转录因子CAAT增强子结合蛋白（C/EBP）合成，并且抑制其DNA连接蛋白活性。因此，两者共同作用可抑制肝脏Hepcidin的表达。随后Harrison-Findik[23]又使用乙醇脱氢酶特异性抑制剂4-甲基吡唑和抗氧化剂维生素E阻断酒精性脂质过氧化反应后则消除了上述的抑制作用，从而有力地说明了酒精引起的脂质过氧化在抑制肝脏Hepcidin合成中起着重要的作用，其机制是通过影响C/EBP表达来调节肝脏Hepcidin转录与合成，并反馈性地增加十二指肠铁的吸收。

众所周知，Hepcidin在肝脏实质细胞中特异性的表达，但是与体外实验相比，发现体内实验中Hepcidin下降得更为显著，提示肝脏中有某些非实质细胞参与了调节，例如巨噬细胞，后者在酒精性肝病发病机制中起着重要的作用。酒精能够下调肝细胞Hepcidin的表达，而炎症反应则上调Hepcidin的表达。因此，巨噬细胞与炎症反应在酒精调节Hepcidin中的总体作用一直存有争议。Nemeth E等[26]通过体外实验证明TNF-α能够下调Hepcidin的表达。肝脏实质细胞和肝巨噬细胞在酒精调节Hepcidin过程中共同发挥作用。但Nemeth研究中也发现IL-6可以显著诱导肝细胞和实验小鼠表达Hepcidin。那么炎症因子在酒精调节Hepcidin中的关系以及是否有其他非实质细胞参与其中仍需进一步研究。

四、总结

目前酒精调节肝脏Hepcidin的分子机理已经基本明确。酒精通过脂质过氧化反应抑制C/EBP的结合活性以及肝脏Hepcidin转录，从而下调Hepcidin表达。肝脏Hepcidin分泌减少导致小肠转铁蛋白表达增加。肝脏Hepcidin代谢紊乱可能是酒精引起铁沉积的一个基础病因。酒精性肝病在我国的发病率呈逐年上升趋势，而铁作为酒精性肝病的二次打击因子倍受重视。我国研究显示表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）能通过类铁螯合剂作用上调Hepcidin表达，减轻铁负荷，对酒精性肝病起到保护作用。因此，进一步研究Hepcidin在酒精与铁稳态的分子机制将有助于早期发现及治疗酒精性肝损伤。尽管关于Hepcidin还存在很多疑点，但应用Hepcidin竞争剂和拮抗剂治疗和预防贫血以及各种与肝铁代谢紊乱有关的疾病具有积极的意义。

[1]AISEN P，ENNS C，WESSLING-RESNICK M.Chemistry and biology of eukaryotic iron metabolism[J].Int J Biochem Cell Biol，2001，33（10）:940-959.

[2]中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.酒精性肝病诊断标准[J].中华肝脏病杂志，2003，11（2）:17.

[3]SUZUKI Y，SAITO H，SUZUKI M，et al.Up-regulation of transferrin receptor expression in hepatocytes by habitual alcohol drinking is implicated in hepatic iron overload in alcoholic liver disease[J].Alcohol Clin Exp Res，2002，26（8）:26-31.

[4]SUZUKI M，FUJIMOTO Y，SUZUKI Y，et al.Induction of transferrin receptor by ethanol in rat primary hepatocyte culture[J].Alcohol Clin Exp Res，2004，28（8）:98-105.

[5]BELL H，SKINNINGSRUD A，RAKNERUD N，et al.Serum ferritin and transferrin saturation in patients with chronic alcoholic and non-alcoholic liver diseases[J].J Intern Med，1994，236（3）:315-322.

[6]IRVING MG，HALLIDAY JW，POWELL LW.Association between alcoholism and increased hepatic iron stores[J].Alcohol Clin Exp Res，1988，12（1）:7-13.

[7]DUANE P，RAJA KB，SIMPSON RJ，et al.Intestinal iron absorption in chronic alcoholics[J].Alcohol Alcohol，1992，27（5）:539-544.

[8]GANNE-CARRIE N，CHRISTIDIS C，CHASTANG C，et al.Liver iron is predictive of death in alcoholic cirrhosis:a multivariate study of 229 consecutive patients with alcoholic and/or hep atitis C virus cirrhosis:a prospective follow up study[J].Gut，2000，46 （2）:277-282.

[9]IOANNOU GN，DOMINITZ JA，WEISS NS，et al.The effect of alcohol consumption on the prevalence of iron overload，iron deficiency，and iron deficiency anemia[J].Gastroenterology，2004，126（5）:1293-1301.

[10]JR-VALERIO LG，PARKS T，PETERSEN DR.Alcohol mediates increases in hepatic and serum nonheme iron stores in a rat model for alcohol-induced liver injury[J].Alcohol Clin Exp Res，1996，20（8）:1352-1361.

[11]EICHNER ER，HILLMAN RS.The evolution of anemia in alcoholic patients[J].Am J Med，1971，50（2）:218-232.

[12]OHHIRA M，OHTKE T，MATSUMOTO A，et al.Immunohistochemical detection of 4-hydroxy-2-nonenalmodified-protein adducts in human alcoholic liver diseases[J].Alcohol Clin Exp Res，1998，22 （3 Suppl）:145-149.

[13]LI CJ，NAN-JI AA，SIAKOTOS AN，et al.Acetaldehyde-modified and 4-hydroxynonenal-modified proteins in the livers of rats with alcoholic liver disease[J].Hepatology，1997，26（3）:650-657.

[14]KRAUSE A，NEITZ S，MAGERT HJ，et al.LEAP-1，a novel highly disulfide-bonded human peptide，exhibits antimicrobial activity[J].FEBS Lett，2000，480 （2-3）:147-150.

[15]PARK CH，VALORE EV，WARING AJ，et al.Hepcidin，a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver[J].J Biol Chem，2001，276（11）:7806-7810.

[16]NEMETH E，GANZ T.Regulation of iron metabolism by hepcidin[J].Annu Rev Nutr，2006，26:323-342.

[17]PIGEON C，ILYIN G，COURSELAUD B，et al.A new mouse liver-specific gene，encoding a protein homolo－gous to human antimicrobial peptide hepcidin，is overexpressed during iron overload[J].J Biol Chem，2001，276（11）:7811-7819.

[18]NICOLAS G，CHAUVET C，VIATTE L，et al.The gene encoding the iron regulatory peptide hepcidin is regulated by anemia，hypoxia，and inflammation[J].J Clin Invest，2002，110（7）:1037-1044.

[19]NICOLAS G，BENNOUN M，DEVAUX I，et al.Lack of hepcidin gene expression and severe tissue iron overload in upstream stimulatory factor 2（USF2）knockout mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（15）:8780-8785.

[20]NICOLAS G，BENNOUN M，PORTEU A，et al.Severe iron deficiency anemia in transgenic mice expressing liver hepcidin[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（7）:4596-4601.

[21]NEMETH E，TUTTLE MS，POWELSON J，et al.Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization[J].Science，2004，306（5704）:2090-2093.

[22]NISHINA S，HINO K，KORENAGA M，et al.Hepatitis C virus-induced reactive oxygen species raise hepatic iron level in mice by reducing hepcidin transcription[J].Gastroenterology，2008，134（1）:226-238.

[23]HARRISON-FINDIK DD，SCHAFER D，KLEIN E，et al.Alcohol metabolism-mediated oxidative stress downregulates hepcidin transcription and leads to increased duodenal iron transporter expression[J].J Biol Chem，2006，281（32）:22974-22982.

[24]OHTAKE T，SAITO H，HOSOKI Y，et al.Hepcidin is down-regulated in alcohol loading[J].Alcohol Clin Exp Res，2007，31（1）:2-8.

[25]HARRISON-FINDIK DD，KLEIN E，CRIST C，et al.Iron-mediated regulation of liver hepcidin expression in rats and mice is abolished by alcohol[J].Hepatology，2007，46（6）:1979-1985.

[26]NEMETH E，RIVERA S，GABAYAN V，et al.IL-6 mediates hypoferremia of inflammation by inducing the synthesis of the iron regulatory hormone hepcidin[J].J Clin Invest，2004，113（9）:1271-1276.