DNA甲基化及检测方法研究进展

李媛媛，龚 晓，包云飞，洪亚辉

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

DNA甲基化是一种重要的遗传修饰，是表观遗传学（epigenetics）研究的重要内容[1]。其主要形式包括5-甲基胞嘧啶（5-mC）、N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。在哺乳动物中，DNA甲基化是必不可少的，它广泛存在于转座子元件、功能基因编码群和重复的DNA中，且几乎所有的甲基化存在于CpG二核苷酸对中。在植物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG二核苷酸对及CNG三核苷酸对中，大约有20%～30%的核基因组DNA胞嘧啶处于甲基化状态。

1 DNA甲基化的机制及DNA甲基转移酶

DNA甲基化作用机制是在甲基转移酶（DNA methyltransferase，MTase）的催化作用下从甲基供体S-腺苷酰甲硫氨酸（SAM）分子中的甲基化基团添加到DNA分子中的碱基上，最常见的是加在胞嘧啶上，形成 5-甲基胞嘧啶（5-mC）[2]。

DNA甲基化状态通过DNA甲基转移酶来维持。细胞中存在几种甲基化酶：一种是维持型甲基转移酶，需以半甲基化的双链DNA为模板，指导新合成的链甲基化；一种是全新甲基化酶，不依赖半甲基化DNA分子中的甲基化模板而从新开始合成5 mC[3]。在植物中，大部分非CG位点的甲基化由从头合成甲基化酶催化。全新甲基化酶可以使以前没有被修饰过的DNA产生甲基化，即重新甲基化，其作用位点为CG、CNG和CNN序列。植物细胞中存在染色质甲基化酶，是植物所特有的一类甲基化酶，该酶催化位于异染色质区和甲基化位点沉默区的CNG序列的甲基化[4]。

2 检测甲基化的方法

目前，甲基化检测的方法大致有以下几类：（1）利用甲基化敏感的限制性内切酶结合聚丙烯酰胺凝胶电泳（MSAP）进行多态性检测；（2）利用亚硫酸氢盐修饰法；（3）芯片技术。

2.1 MSAP检测方法

目前研究植物基因组甲基化多采用该种检测方法，MSAP是在扩增片段长度多态性（AFLP）基础上，把该法中的内切酶替换为对甲基化敏感程度不同的一对同裂酶HpaII和MspI。这对酶可识别CCGG位点，但对甲基化的敏感程度不同：前者对内、外侧胞嘧啶甲基化敏感，后者只对外侧胞嘧啶甲基化敏感，而绝大多数基因组甲基化发生在胞嘧啶内侧，因此可以用MspI来识别CCGG，用HpaII来鉴别这些序列是否甲基化。这是一种简便的成本较低的检测DNA甲基化的方法，实验结果位点明确且容易解释，但也存在一定的缺点：由于甲基化位点不仅仅存在于CCGG，也可能存在于CG中，故CG中的甲基化会被忽略，造成结果的误差。

2.2 亚硫酸氢盐法

亚硫酸氢盐可将未甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U，然后进行PCR扩增，U将与A配对产生T，而甲基化的C则不会被亚硫酸盐修饰，这样DNA包含的甲基化信息就转变为具有差异的DNA序列[5]。如今在Sodium bisuIfite法基础上又产生了许多甲基化检测的方法，包括如DNA甲基化荧光PCR检测、结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析法、甲基化敏感性高分辨率熔解、甲基化敏感的单核苷酸的扩增、酶的区域性甲基化特异性分析、芯片杂交技术等等。

2.2.1 甲基化特异性PCR法（MSP） 甲基化特异性PCR也是检测基因甲基化的经典方法。MSP法的原理是用亚硫酸氢盐处理目的DNA，然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态[6]。MSP法中引物设计的要求：（1）设计两对引物，其末端均设计至检测位点结束；（2）两对引物中一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链。检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对处理后的非甲基化DNA链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。MSP法具有灵敏度较高、应用范围广的优点。

2.2.2 DNA甲基化荧光PCR检测 DNA甲基化荧光PCR检测是利用重亚硫酸盐处理目的DNA片段后，设计一个能与待测位点区互补的探针，在其5’末端标记一个荧光报告基团，3’末端标记一个荧光淬灭基团，随后进行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR引物延伸时，Taq酶发挥其5’至3’外切酶活性，将能与模板杂交的探针切碎，报告基团与淬灭基团分离，荧光信号释放，可被检测，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化水平情况[7]。该方法具备灵敏度高、所需样本量少、不需要电泳分离、可重复等优点。缺点是费用高，测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物，且受较多因素影响。

2.2.3 结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析法（COBRA） 亚硫酸氢钠处理的DNA经PCR扩增后会产生新的酶切位点。目的片段扩增后用识别序列需包含CG的内切酶消化，如BstUI（识别CGCG）。若其识别序列中的C发生完全甲基化，则PCR扩增后保留为CGCG，此时BstUI能够识别并进行切割；若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR扩增后转变为TGTG，BstUI不可识别此位点，不能进行切割[7]。这样酶切产物经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。该法的优点是：方法相对简单，不需预先知道CpG位点及样本序列；可进行甲基化水平的定量研究；需要样本量少。缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测结果呈阴性也不能排除样品DNA中甲基化存在的可能。

2.2.4 甲基化敏感的单核苷酸的扩增（Ms—SnuPE） 甲基化特异的单核苷酸扩增能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化情况的定量方法。其原理是先用重亚硫酸盐处理基因组DNA后PCR，然后取等量扩增产物置于两管中，分别作为Ms—SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms—SnuPE延伸的引物，其3’末端紧靠待测目的碱基。同时在两个反应体系中加入等量的引物、同位素标记的dCTP或dTTP、Taq酶等。如待测位点被甲基化，则被同位素标记的dCTP会在延伸反应中连至引物末端；如果未被甲基化，则标记的dTTP可参与反应。末端延伸产物经琼脂糖凝胶电泳分离和放射活性测定后可得出C／T值，此值为甲基化与非甲基化的比值，由此分析得到目的片段中CpG位点的甲基化情况[8]。

2.2.5 甲基化敏感性高分辨率熔解（MS-HRM）高分辨率熔解是一种最新的遗传学分析方法，是一种不需要PCR产物后续操作的简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。采用重亚硫酸盐处理DNA模板后在PCR反应前，在非CpG岛位置设计一对针对经亚硫酸氢钠处理后DNA链的引物，这对引物中间包含有意义的甲基化CpG岛，一旦这些CpG岛发生甲基化，胞嘧啶不发生变化，而未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶，样品中的GC含量发生了变化，最终被转化成了熔解曲线Tm值之间的差异。CpG位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰的形状产生影响，因此，根据Tm值和熔解峰的形状可以检测出样本的甲基化位点和甲基化程度[9]。

2.3 甲基化检测芯片技术

基因芯片技术的出现为检测DNA甲基化的高通量提供了技术平台，然而检测芯片的研究近几年刚刚起步。目前国际上仅几个研究小组在开展DNA甲基化芯片的研究工作。各种芯片技术以不同的DNA预处理方法为基础，包括限制性内切酶和免疫沉淀等。结合限制性酶的芯片方法具有较高的灵敏度，免疫沉淀方法则特异性高。

2.3.1 限制性酶结合芯片技术的方法 有以下三种限制性内切酶可用于与芯片技术结合检测DNA甲基化：第一种是甲基化依赖型限制性内切酶；第二种是对甲基化敏感性不同的同裂酶；第三种是甲基化敏感性内切酶[10]。

2.3.2 免疫沉淀与芯片方法的结合应用 免疫沉淀与芯片方法的结合应用包括以下几种：第一种是依赖5-甲基胞嘧啶抗体免疫沉淀富集甲基化片段的方法；第二种是利用甲基化结合蛋白（MBD）免疫沉淀甲基化DNA片段的方法[11]。

3 展望

随着对表观遗传学研究的深入，DNA甲基化检测方法也得到了快速的发展。目前英国科学家提出，单分子纳米孔测序仪能直接分辨出甲基化胞嘧啶和未修饰的胞嘧啶。当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。纳米孔技术就能直接读出这5-甲基胞嘧啶。

在表观遗传学的研究中，DNA的甲基化直接制约着基因的活化状态，在生命过程中具有十分重要的功能。DNA的甲基化与高等生物的生长发育密切相关，与肿瘤的发生发展也有重要的关系，此外还与X染色体失活、基因印记[3]等有重要联系。研究DNA甲基化具有重要的意义。在亚硫酸氢盐法的基础上，结合甲基化敏感性高分辨率熔解技术等新科技，以及可进行高通量检测的芯片技术的兴起和发展，都为更好地检测和研究甲基化提供了宽广的平台。

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