重金属富集模式动物粉正蚓Lumbricus rubellus的研究

李 维，吴文如，林小桦，喻良文，李 薇

(广州中医药大学，广东广州 510006)

·方药研究·

重金属富集模式动物粉正蚓Lumbricus rubellus的研究

李 维，吴文如，林小桦，喻良文，李 薇＊

(广州中医药大学，广东广州 510006)

粉正蚓Lumbricus rubellus作为一种富集重金属离子的模式动物，是近年来国内外学者研究重金属富集机制及调控原理的重点关注对象。对粉正蚓重金属富集相关的国内外研究现状进行了系统地梳理和分析，同时还总结了重金属富集研究的方法，并提出了今后研究的发展方向，以期为重金属富集相关的研究提供可以借鉴的思路和方法。

粉正蚓;重金属富集;金属硫蛋白;重金属响应元件;应用

粉正蚓Lumbricus rubellus为环节动物门寡毛纲(Oligochaeta)动物，原产于包括英国等国在内的欧洲大陆，后经殖民活动传播至美洲，现整个太平洋地区均有广泛分布[1]。粉正蚓不仅因其药食皆用而与民众生活息息相关，同时也因其常生活于矿质土中，通过不断地纵横钻洞，掘穴松土、破碎、分解有机物和吞土排粪等生活习性，能高效地吸食和分解有机物质、改良土壤，而成为土壤生物学和生态学的动物研究模型[2]。特别是近年粉正蚓体内能耐受蓄积高浓度的重金属离子的现象被发现后，粉正蚓又成为国外学者关注的热点:一方面以粉正蚓为代表研究动物体内重金属富集的机制;另一方面利用其进行重金属污染土壤的修复和改造。

笔者所在研究组在研究中药地龙重金属含量超标时也发现地龙某些来源的原动物，如参环毛蚓Pheretima aspergillum，具有与粉正蚓相似的重金属富集特性，该结果将另文报道。考虑到参环毛蚓与粉正蚓的分类学上的亲缘关系以及相似的生物学特性，本文着重对粉正蚓重金属富集相关的国内外研究概况进行了系统地梳理和分析为本组进一步研究地龙的重金属富集机制寻求可供借鉴的思路和方法，同时也对其他类似研究工作提供参考依据。

1 粉正蚓重金属富集特性的发现和确定

粉正蚓成虫长约60～140 mm，背赤红有光泽而腹白，因此，国外有人称其为“红色蠕虫”(Red Wriggler)。由于这种蚯蚓既可食用、也具备一定的临床药用价值，所以在与人类相关的食物链中扮演着重要的角色。然而，研究者们偶然发现了粉正蚓能够生存在重金属污染较严重的地区，并且能够蓄积其进食土壤中的重金属元素，尤其是对镉(Cd2+)和铜(Cu2+)具有较高的耐受能力，其Cd2+含量甚至可以达到干体重的1/1 000[3]，远高于其他类别的蚯蚓。粉正蚓的重金属富集特性的发现，使其更加成为学者们的研究热点。特别是在当今关注环境的热潮里，人们又把粉正蚓作为环境中重金属污染程度的生态监测指标(Biomarker)[4]，并研究如何将粉正蚓用于改善生态土壤环境，使其成为清除土壤重金属的工具[5]。

随着研究不断地深入，人们发现粉正蚓不仅能够被动地耐受镉、铜、铅、汞、锌、锶等各类金属离子，而且还对某些重金属离子存在着主动富集的特性[6]。Stürzenbaum SR[7]考察了英国 Rudry 地区 (矿区)粉正蚓与当地泥土中重金属浓度的相关性，该地区土壤中分别含铅(Pb)2337μg/g、锌(Zn)5902μg/g、镉(Cd)604μg/g(干重) ，粉正蚓体内含铅 (Pb)892μg/g，锌(Zn)2 470μg/g，镉(Cd)1 213μg/g(干重)。结果表明，锌、铅在粉正蚓体内含量相应地均比同重量泥土中的含量要低，而镉在粉正蚓体内含量则比土壤中含量高出一倍。由此可见，与锌、铅相比，粉正蚓对重金属镉存在着高浓度主动蓄积的现象。

随后，研究人员又对重金属离子镉在粉正蚓体内的分布规律进行了研究，并发现，镉离子对重金属的吸收主要集中在粉正蚓肠部上皮以及肠道皱褶，而黄色细胞囊组织则是重金属镉的最主要分布组织;在钙腺及其囊泡中也发现有镉的分布，但因分布较少，认为可能不是镉离子的主要排泄途径，同时肾管部分也涉及到镉离子的排泄，并且是一个会引发病理损害的主要靶点，而镉离子在外部的表皮及纵肌组织中的分布则微乎其微[8]。

对于不同的金属离子，来源于受不同程度重金属污染土壤的粉正蚓种群存在着适应性的差异。英国学者Edward F[9]采用了系统的非稳态动力学实验对粉正蚓的重金属富集特性进行考察，非稳态动力学的研究包括了吸收实验(蚯蚓从未受污染的地区转移至受污染地区)和消除实验(蚯蚓从受污染地区转移至未受污染地区)，实验中把排泄时间作为一个重要变量，检测不同时间里蚯蚓体内的重金属浓度。吸收实验发现，粉正蚓对镉，铜，铅，镍和锌的富集都在一定程度上依赖于土壤中的金属浓度;而富集效率在含低浓度的重金属土壤中更大。而消除实验则发现，粉正蚓在对重金属排泄过程中保留了对镉的蓄积，其体内含量随着排泄时间的增加反而不断提高。目前对粉正蚓的非稳态动力学研究非常广泛，改良方法也多样。例如，Mari～no F[10]为了考察粉正蚓对不同栖息环境的适应性，将分别来源于含钙和含锶丰富土壤的同类蚯蚓引进至不受重金属污染的土壤中饲养，经消除实验后再交叉转移至对方的栖息土壤中交叉饲养，结果发现，源于含锶地区的蚯蚓能够富集更多的钙。而又有学者在其基础上设计对粉正蚓种群及其后代对重金属吸收程度的遗传特性研究[11]，或者研究不同地区种群的粉正蚓对各类金属离子的生物积累过程[12]。总之，各种实验均证实:粉正蚓对镉等重金属有害元素具有显著的耐受和富集作用。

2 粉正蚓重金属富集机制的探索

粉正蚓能够在体内富集不同类型的重金属离子，这一现象引发了人们对其重金属富集机制的探索与研究。Stürzenbaum SR等[3]通过凝胶色谱技术对粉正蚓体内具有与镉紧密结合的蛋白质进行提取分离，然后进行氨基酸末端序列分析，研究表明，粉正蚓种系中具有金属响应特性的蛋白具备其他种系动物金属硫蛋白的共同特征，是生物体金属硫蛋白(Metallothioneins，MT)家族的一员。Morgan AJ等[13]通过收集重金属污染严重的泥土中粉正蚓样品，并使用针对金属硫蛋白的多克隆抗体对粉正蚓进行免疫染色实验，发现金属硫蛋白主要存在于粉正蚓体内的多孔结构中，与形似于溶酶体的物质共存。其分布主要在:肠表皮细胞的顶端细胞质里;与肠相连的临近的胞腔中;肾管的狭窄管状区域以及钙腺的上皮细胞分泌物中。从上述研究结果中发现，金属硫蛋白的分布与重金属离子的分布具有高度的相似性，这也印证了金属离子在粉正蚓体内是通过与金属硫蛋白结合的方式进行蓄积、分布以及代谢的。

现代研究表明，MT是一类广泛存在于生物界的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，具有参与机体微量元素储存、运输和代谢、拮抗电离辐射、清除羟基自由基、重金属解毒及参与激素和发育调节、增强机体应激反应等广泛的生物学功能[14]。MT能结合汞、镉、铅等有毒重金属离子，而且结合后就成为稳定的MT的一部分，从而使其失去对细胞的毒害作用。为验证粉正蚓对镉金属离子的高度特异富集特性，Thanh T等[15]开展了对其金属硫蛋白具体结合的研究，通过紫外吸收、圆二色谱和电喷雾电离质谱pH滴定实验发现，20个半胱氨酸(Cys)的MT-2能够与和7个Cd2+结合，而20个半胱氨酸分裂成了两个分离的序列区域，其中11个 Cys在N氨基末端，9个Cys在C氨基末端。因此，镉离子与MT-2的结合方式可以推断为Cd3Cys9和Cd4Cys11。实验显示了粉正蚓MT与已知的其他的MT存在显著的差异，也证实了粉正蚓的MT-2对镉具有较大差异的“肽结合域”。

随着分子生物技术的发展，人们越来越多地把研究目光放在了基因转录水平方面。现代研究对生物体代谢重金属的基因调控模式研究主要集中在“谷胱苷肽再生说”以及“金属硫蛋白合成说”，前者是使已与金属结合过的谷胱苷肽迅速恢复其结合能力;而后者是通过上调wMTs编码基因，诱导性产生大量的能与重金属离子结合的MT[16]。“金属硫蛋白合成说”无疑更符合人们对粉正蚓重金属代谢模式的猜想。英国学者S.R.Stürzenbaum率先在粉正蚓的肠上皮和胚胎等组织成功分离出了3个随重金属浓度诱导性上调的wMTs编码基因:wMT-1、wMT-2和wMT-3[3]，从而再次在基因层面为证实粉正蚓在重金属富集方面采用金属硫蛋白途径的生物调控模式提供了确切的证据。

现代科学研究发现，重金属对wMTs基因的诱导表达是一个严密而复杂的过程，它与MT基因功能区的调控作用有着紧密的联系。基因诱导表达的一般过程为:生物体内预先存在一种或多种金属效应转录因子 (Metal-responsive Transcription Factors，MTFs) ，当其与金属离子结合后便诱导产生变构，进而与生物体内普遍存在的金属应答元件MREs(Metal Responsive Elemen)[17]结合，对效应基因进行调控，促发MT的mRNA转录。而在MTs基因启动子部分的多个调控部件中，MREs是唯一的能与金属调节蛋白转录因子(MTF)靶向结合的基因调控元件[18]，而且是已知调控元件中最具特异性的介导重金属对MT基因转录诱导的顺式作用元件，是金属元素控制基因转录的重要位点。

因此，研究MREs表达调控的过程及其分子调控机制，同时研究参与MT表达调控的各类因子，对其各自的作用进行分析比较，进一步寻找相应的反式调控因子，为实现在基因层面控制其对重金属离子的富集或者加速其排泄寻求可能性，这对于本团队研究在源头上解决地龙药材重金属超标问题提供了重要的借鉴。

3 粉正蚓研究的应用前景

粉正蚓的基因研究成果能够为我们在做进一步研究以及对相关物种开展研究提供高效的参照平台。第7届国际蚯蚓生态学座谈会在粉正蚓基因研究信息普及共享方面作出了突出的贡献。会议论述了EST(Expressed Sequence Tag，表达序列标签，指一排从cDNA互补文库中随机产生并且提供一种方法能用于获取大量编码cDNA序列信息的简短的单一的可阅读序列)工程的进展，并对蚯蚓EST工程进展进行了一个简要的概括:蚯蚓 EST工程发展非常迅速，对粉正蚓基因始端577个排序的分析能够对应大约400种不同的基因，其中79种可以由两个或多个EST来表述。已知蛋白具有显著序列相似性而被发现的有76%，剩余的24%被归类为新基因[19]。英国学者S.R.Stürzenbaum通过使用生物信息学工具，建造了一个蚯蚓序列信息的关系数据库-LumbriBASE，通过互联网界面(http://www.earthworms.org)，所有相关研究者均可以进行关键词搜索和序列相似性比对，对于重金属富集动物的相关研究起到了巨大推动作用。

21世纪人类的生产活动和全球工业化进程的加剧，世界许多国家和地区的空气、土壤及水体面临着越来越严重的重金属污染的危害，重金属在土壤中产生的污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性等特点[20]，不但会严重影响动植物的产量与品质，更重要的是通过食物链或药物危害人类的生命和健康。因此与土壤或水域相关的动植物系统中的重金属污染成为评价动植物品质的重要指标，由于粉正蚓的普遍存在以及其重金属富集特性，使它成为了世界上许多发达国家的生物研究、生态环境研究的动物研究模型[21]。近年有报道科学家在英国一处废弃的矿井发现了变异的蚯蚓，这种蚯蚓能在被严重污染的有毒土壤环境中生存下来，并吃掉这些污染土壤的重金属[22]。因而有科学家也开始研究粉正蚓的基因变异调节，从而

考虑把其可作为改善重金属生态污染的重要解决手段[23]。而随着药学研究在利用蚯蚓提取物蚓激酶[24]、纤溶酶[25]等用于治疗心脏病、肿瘤等常见疾病方面的发展，国内外对蚯蚓的应用也提升到一个新的平台。解决食物链中的重金属转移，解决生态环境问题，解决临床药用安全等一切与人类生存密切相关的问题，都要求着我们对蚯蚓作出更深入和更全面的研究。

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R284.3

A

1007-4813(2010)05-0762-04

国家自然科学基金项目(No.30772741)，广东省科技计划项目(No.2007B020701004和No.2009B06070006)。

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李 薇，教授。E-mail:liwei-li@163.com.cn

2010-5-04)