微囊藻毒素完全抗原的研制

张 爱,孙长青,周 圆,铁 程,金 玉,杨 良

(1.云南大学,云南昆明650091;2.昆明理工大学,云南昆明650091;3.云南省环境监测中心站,云南昆明650034)

微囊藻毒素完全抗原的研制

张 爱1,孙长青1,周 圆2,铁 程3,金 玉3,杨 良3

(1.云南大学,云南昆明650091;2.昆明理工大学,云南昆明650091;3.云南省环境监测中心站,云南昆明650034)

为研制通用性微囊藻毒素(Microcystins,MCs)完全抗原,首先选用硫醇盐将微囊藻毒素氨基衍生化,利用戊二醛两步法合成完全抗原,戊二醛的两个醛基分别与微囊藻毒素和牛血清白蛋白上的氨基发生反应,形成稳定的Schiff碱,从而达到微囊藻毒素的完全抗原化。结果显示,偶联比在3～18∶1,平均偶联比为8∶1,可作为下一步免疫的完全抗原使用。

微囊藻毒素;戊二醛两步法;完全抗原

微囊藻毒素(MCs)种类繁多,目前所发现的微囊藻毒素异构体有60多种。但它们有共同的特点,如图1所示[1,2]:环状七肽(D-丙氨酸-LX-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-Z-Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸),变化主要在于第2位X、第4位Y氨基酸的不同,第5位氨基酸Adda(3-氨基9-甲氨基2,6,8-三甲基10-苯基4,6-二烯酸)是微囊藻毒素生物活性表达所必须的。其中MC-LR型最为常见,毒性最强急性危害最大。本文以MC-LR的酶联免疫法测试盒研制为最终目标,对MC-LR完全抗原的制备研究展开讨论。

1 材料与方法

1.1 材料

微囊藻毒素-LR(自制)、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、NaOH、高纯氮、冰醋酸、乙腈、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、甲醇均为分析纯,三氟乙酸(TFA,Jtbaker)、500mgWaters Sep2 Pak C18cartridge、氮吹仪、2-巯基乙胺、戊二醛均为Sigma、牛血清白蛋白(BSA,Solarbio)、透析袋(M=8000-15000,鼎国)。

1.2 方法

利用乙胺硫醇盐巯基的较强亲核加成反应特点,在微囊藻毒素的第7位氨基酸不饱和双键位置(图1右上角圆圈所示)发生Michael加成反应而使微囊藻毒素活化,从而链接上可用于蛋白质交联反应的活性基团游离氨基[3～6];然后采用戊二醛两步法通过醛基与伯氨基之间形成Schiff碱,将已活化的微囊藻毒素和牛血清白蛋白耦联(见图2)起来[5,7]。

2 具体操作过程

2.1 微囊藻毒素的氨基化

(1)把MC-LR按1～5mg/ml溶于乙醇中,取1体积MC-LR溶液与1.5体积的去离子水、2体积的二甲基亚砜(DMSO)、0.67体积5mol/L的NaOH以及1g/ml溶于去离子水的2-巯基乙胺体系混合,置于氮吹仪50℃下孵育30min。

(2)反应结束冷却至室温,加入与体系等体积的冰醋酸终止反应,并用0.1%的三氟乙酸溶液稀释至5倍,用三氟乙酸调节pH至1.5。

(3)上样过500mgWaters Sep-Pak C18柱纯化产物,柱子先用一管乙腈活化,再用一管去离子水调节活化,过完柱先用含0.1%三氟乙酸的10%乙腈溶液洗脱杂质,待萃取柱吹干后用含0.1%三氟乙酸的乙腈洗脱微囊藻毒素并收集。

2.2 戊二醛两步法合成微囊藻毒素完全抗原

(1)按3mg/ml溶解于H2N-e tMC-LR与0.01mol/L PBS里,加入等体积的10%戊二醛PBS溶液,室温振荡反应4h以上。

(2)反应结束上样过500mg Waters Sep-Pak C18柱纯化所得产物(用甲醇活化、洗脱)。

(3)用氮吹仪吹干甲醇并溶解于3ml 0.01mol/L的PBS里,按MC-LR∶BSA为10∶1加入1mg/mlBSA溶液,振荡反应4h以上。

(4)反应结束,将混合液转移至透析袋中于0.01mol/L PBS中振荡透析24h,并每隔8h更换PBS溶液。

3 产物的鉴定及结果

3.1 H2N-e tMC-LR的鉴定及结果

用质谱仪直接测量分子量范围。本实验采用的是EI离子源,MC-LR的相对分子量为995.2D,2-巯基乙胺的相对分子量为77D,故目标产物的分子量应是1072.2D。由图3可看出相应的质荷比为1073的峰,以及很强的双电荷峰537,所以理论值与实际值是一致的,表明这一步的氨基修饰是成功的。

3.2 微囊藻毒素完全抗原的鉴定

3.2.1 定性分析

运用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术对合成物做定性分析。如图4所示,向上、向下箭头所指分别代表标准蛋白中牛血清白蛋白以及测试样品中目标物(MC-LR-BSA)的电泳情况。目标物(MC-LR-BSA)的条带明显宽于标准蛋白条带,说明目标物的平均分子量范围都大于牛血清白蛋白,这说明微囊藻毒素与牛血清白蛋白的耦联是成功的。

3.2.2 定量分析

采用生物质谱技术对目标物进行定量分析,本试验所合成的完全抗原经透析纯化和脱盐处理后经MALD I-TOF-MS检测,得到如图5所示的质谱图。

由质谱图可知,75307.7是偶联物的最大信号所对应的分子量值,牛血清白蛋白的分子量范围在67000左右,合成的H2N-e tMC-LR的分子量为1072.2,因此可以看成在牛血清白蛋白上每连接上一个H2N-e tMC-LR,分子量增加1000。从图5可看出合成MC-LR-BSA的分子量范围在70000～85000,也即偶联比MC∶BSA=(3～18)∶1,而平均偶联比为MC∶BSA=8∶1。由此进一步说明微囊藻毒素与牛血清白蛋白的耦联是成功的,可以作为下一步动物免疫的完全抗原使用。

4 讨论和展望

(1)在微囊藻毒素的氨基衍生化反应过程中存在不同的实验现象:反应的最终混合溶液的颜色有两种,一种是浅紫色,一种是淡黄色。后经质谱鉴定,结果显示有同样的质谱图,且对往后合成的完全抗原也没有影响。笔者猜测,可能是异构体,这有待进一步验证。

(2)戊二醛两步法过程中反应时间是关键,反应时间为1h时只有很少的藻毒素联接上,反应时间为4h时达到最高。具体的反应时间与结合率的关系还有待进一步的研究。

[1]Welker M,Steinberg C.Indirect photolysis of cyanotoxins:one possible mechanism for their low persistence[J].Wat Res,1999,33(5).

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[4]蒋成淦.酶免疫测定法[M].北京:人民卫生出版社,1984.

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[6]盛建武,何苗,宋保栋,等.微囊藻毒素2LR完全抗原的设计及制备[J].环境科学,2005,26(3).

[7]By Ed Harlow,Cold Spring Harbor.Antibodies A Laboratory Man2 ual.Cold Spring Harbor,1988.

Advance of MicrocystinsπComplete Antigen

ZHANG Ai1,SUN Chang2qing1,ZHOU Yuan2,TIE Cheng3,JIN Yu3,YANG Liang3
(1.Yunnan Nniversity,Kunming Yunnan 650091 China)

Mercaptide is used to make MCs into derivatization of amino firstly,then the immunogenicity antigen is synthesized with Glutaraldehyde two-step method.Both of aldehide groups of Glutaraldehyde react with amino of Bovine Serum Albumin(BSA)ofMCs respectively and produce a stable Schiff base,in the end,the complete anti2 gen of MCs is synthesized theoretically.The results show that the coupling rate between MCs and BSA is 3 and 18 to 1,and the average coupling rate is 8 to 1.The complete antigen ofMCs can be used in immunity sufficiently.

microcystins(MCs);Glutataldehyde two-step method;complete antigen

X17

A

1673-9655(2010)03-0001-03

2010-03-10