HPLC法同时测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量Δ

郭淑英，冯波（吉林医药学院药学院，长春市132013）

夏枯草（Prunella vulgarisL.）始载于《神农本草经》，列为下品，因“此草夏至后即枯”而得名，2005年版《中国药典》记载的夏枯草是唇形科夏枯草属植物的干燥果穗[1]。夏枯草主要含有三萜及其苷类、苯丙素类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机酸、挥发油及糖类等成分。其中，齐墩果酸和熊果酸由于其结构的相似性，几乎在植物体中同时存在[2]，对其含量测定难度较大。本试验首次在流动相中添加β-环糊精测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量，方法简便、准确、重复性好。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A系列HPLC仪，包括在线真空脱气装置、二元梯度泵、自动进样器、二极管阵列（PDA）检测器和LC-Solution色谱工作站（日本岛津公司）；FA1104N型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

甲醇为色谱纯，水为娃哈哈饮用纯净水，其它试剂均为分析纯；齐墩果酸对照品（批号:080921）、熊果酸对照品（批号:081019）均购自中国药品生物制品检定所；夏枯草购自安徽亳州，经吉林医药学院李景华副教授鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取齐墩果酸和熊果酸对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，用乙醇溶解并定容，即得对照品贮备液，其质量浓度均为0.5 mg·mL-1。精密量取齐墩果酸对照品贮备液1.0 mL和熊果酸对照品贮备液2.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，混匀并用甲醇定容，即得混合对照品溶液，其中齐墩果酸和熊果酸质量浓度分别为0.05、0.1 mg·mL-1。

2.2 供试品溶液的制备

称取夏枯草样品约200 g，用2 000 mL乙醇溶液回流提取，每次2 h，合并滤液，减压浓缩，得深绿色浸膏。将此浸膏加适量水后用正己烷萃取脱脂，再用二氯甲烷萃取。将二氯甲烷萃取部分浓缩蒸干，无水乙醇溶解后用5%NaOH调节溶液的pH＝12，过滤，所得滤液用10%HCl溶液酸化至pH＝2.4，再加入1倍量pH＝2.4的蒸馏水，过滤，所得沉淀用蒸馏水洗至中性，60℃下真空干燥，得到三萜酸富集物。精密称取此富集物0.005 1 g，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得。

2.3 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Tigerkin ODS3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:甲醇-10 mmol·L-1β-环糊精1%醋酸胺水溶液（86∶14）；流速:1.0 mL·min-1；检测波长:210 nm；柱温:40 ℃；进样量:10 μL。齐墩果酸、熊果酸与杂质峰的分离度均＞2.0；理论塔板数按齐墩果酸和熊果酸峰计算均＞6 000。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液10、15、20、30、40、50、60、80、100 μL，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标，制备标准曲线，得齐墩果酸的回归方程为Y＝22 880X+30 405（r＝0.999 2），线性范围为0.5～5.0 μg；熊果酸的回归方程为Y＝42 541X+24 887（r＝0.999 8），线性范围为1.0～10.0 μg。

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，同一浓度取5份，按上述色谱条件测定齐墩果酸和熊果酸色谱峰峰面积。结果，RSD分别为0.79%和1.4%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h测定齐墩果酸和熊果酸色谱峰峰面积。结果，RSD分别为2.2%和1.72%，表明供试品溶液中熊果酸和齐墩果酸在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取夏枯草初纯物（批号:090821），按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，按外标法计算含量。结果，样品中齐墩果酸和熊果酸含量的RSD分别为0.95%和1.45%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号:090821）约2.5 g，共9份，分为3组，按低、中、高浓度分别加入齐墩果酸对照品0.022、0.027 5、0.033 mg和熊果酸对照品0.04、0.05、0.06 mg，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

分别精密吸取“2.1”、“2.2”项下的混合对照品溶液及供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述方法测定样品中齐墩果酸、熊果酸的峰面积，采用外标法计算含量，结果见表2。

3 讨论

齐墩果酸和熊果酸均为五环三萜类成分，分子中仅存在1个双键，通过PDA检测器选取不同波长条件进行对比，发现其均在205 nm波长处有最大吸收，但在此波长下溶剂末端吸收较严重，基线不够理想，故选择210 nm作为检测波长。

由于熊果酸和齐墩果酸的结构极为相似，采用薄层扫描法[3]、毛细管区带电泳-电化学检测法[4]、衍生化气相色谱法[5]和普通的RP-HPLC法[6～11]很难将其完全分离。目前以环糊精为代表的手性选择剂被用于改进对映体的分离，流动相添加剂法不必事先将样品制备成手性衍生物，而只需将手性选择剂加入到流动相中，使手性选择剂与样品形成手性络合物。虽然熊果酸和齐墩果酸不是手性对映体，但可以利用这2种五环三萜酸与环糊精衍生物形成的包合物的色谱行为不同而进行分离。试验证明，在流动相中添加10 mmol·L-1β-环糊精可改善熊果酸与齐墩果酸色谱峰的峰形和分离度，从而提高检测的灵敏度和准确度。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

在样品制备过程中，为了得到更多的三萜类成分，本试验对试样提取后又经萃取和消化过程再进行含量测定；同时又按常规的提取方法做了试样，并以β-环糊精作流动相进行了检测，分离度仍达到2.0以上。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京:化学工业出版社，2005:197.

[2]杜 晖，陈晓青.夏枯草中两种三萜酸的分离测定研究[D].中南大学，2008.

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