RP-HPLC法测定老年咳喘片中补骨脂素和异补骨脂素的含量

覃建明，莫文电（1.广西河池市人民医院药剂科，河池市 547000；.广西河池市药品检验所，河池市547000）

老年咳喘片由黄芪、白术、防风、甘草、黄精、淫羊藿、补骨脂制成，具有滋阴壮阳、扶正固本的功效，可以提高人体免疫能力，促进病体康复，用于治疗老年慢性支气管炎及各种体虚症。补骨脂含香豆精类、黄酮类、单萜酚类以及挥发油、皂苷、多糖、类脂等成分。补骨脂素和异补骨脂素为香豆精类，在补骨脂中含量较高。因此，笔者选取补骨脂素和异补骨脂素作为定量指标来控制本品质量，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法[1～4]测定其含量，并证明该方法简便、快速、灵敏、准确，可用于老年咳喘片的质量控制。

1 材料

1.1 仪器

LC-10ATVPHPLC仪、SPD-10AVP紫外检测器（日本岛津公司）；威玛龙色谱数据工作站（深圳深软电子有限公司）。

1.2 试药

补骨脂素对照品（批号:110739-200613）、异补骨脂素对照品（批号:110738-200410）由中国药品生物制品检定所提供；老年咳喘片（规格:基片重0.3 g；批号:080101、081002、081201、090301等10批）及缺补骨脂的阴性样品由广西某药厂提供；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相:甲醇-水（55∶45）；流速:1.0 mL·min-1；检测波长:246 nm；柱温:30 ℃；进样量:10 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含20µg的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称重，超声处理（功率160 W，频率50 kHz）40 min，放冷，再称重，用甲醇补足失重，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

取不含补骨脂的阴性样品，照“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.5 专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按上述色谱条件各进样10µL，分别记录色谱图。结果，供试品溶液在与对照品溶液补骨脂素和异补骨脂素峰的保留时间处有相应的色谱峰，均达到基线分离；阴性对照溶液无补骨脂素和异补骨脂素的吸收峰。色谱见图1。

2.6 线性关系考察

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram

精密称取补骨脂素对照品9.4 mg、异补骨脂素对照品9.2 mg，置同一100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。精密量取此贮备液0.5、1、2、5、10 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件进样10 μL，测定。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程分别为Y补骨脂素＝7.121 1×106X+5.196 9×103（r＝0.999 9）；Y异补骨脂素＝7.158 9×106X+5.149 5×103（r＝0.999 9）。结果表明，二者进样量依次在0.047 0～0.940 0、0.046 0～0.920 0 μg范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

取混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次。结果，补骨脂素、异补骨脂素峰面积的RSD分别为0.87%、0.63%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取室温放置的同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、12 h进样10 μL，测定补骨脂素、异补骨脂素的峰面积。结果，二者RSD依次为1.65%和1.02%（n＝6），表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

2.9 重复性试验

取同一批（批号:090301）样品6份，同法测定。结果，补骨脂素的平均含量为0.116 mg·g-1，RSD＝0.93%；异补骨脂素的平均含量为0.125 mg·g-1，RSD＝0.81%，表明方法重复性良好。

2.10 耐用性试验

取同一供试品溶液，用2根不同厂家的C18色谱柱（另一根色谱柱为依利特C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）分别以流速0.8、1.0、1.2 mL·min-1进行测定。结果，补骨脂素、异补骨脂素峰面积的RSD依次为1.04%、1.13%（n＝6），表明方法耐用性良好。

2.11 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号:090301）9份，分成3组，按高、中、低3个不同浓度分别精密加入一定量的混合对照品贮备液，水浴蒸干，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依上述方法测定，计算加样回收率。结果，补骨脂的平均回收率为97.70%，RSD＝0.89%（n＝9）；异补骨脂素的平均回收率为98.76%，RSD＝0.84%（n＝9）。

2.12 样品含量测定

取10批样品，按上述色谱条件进样，依法测定含量，每批测定3份，结果见表1。

表1 样品中补骨脂素和异补骨脂素含量测定结果（n＝3）Tab 1 Content determination of psoralen and isopsoralen in Laonian kechuan tablets（n＝3）

2.13 含量限度的拟订

按正文拟订的含量测定方法测定本品10批样品中补骨脂素、异补骨脂素的含量，发现2种成分含量比例差别较大，结合实际考虑，以总含量来拟订测定限度。10批样品中补骨脂素和异补骨脂素的总含量分别是每片77.0、63.3、70.3、64.6、57.6、77.1、80.5、58.2、79.8、72.7 μg，其中总含量最高的是每片80.5 μg，最低的是每片57.6 μg，平均总含量为每片70.1 μg。因此，拟订本品每片含补骨脂以补骨脂素（C11H6O3）和异补骨脂素（C11H6O3）计，总量不得少于60 μg。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，分别加流动相使溶解，在紫外分光光度计上扫描。结果，补骨脂素对照品在246.2 nm波长处有最大吸收，异补骨脂素对照品在246.4 nm波长处有最大吸收，故选择246 nm为检测波长。

3.2 提取溶剂及提取条件的选择

根据补骨脂素、异补骨脂素易溶于甲醇、乙醇等溶剂的物理特性，本试验选用甲醇作为提取溶剂；经回流和超声处理比较，结果用甲醇为溶剂超声处理，可达到完全提取的目的。通过对超声时间15、30、40、50 min的考察，发现提取40 min与50 min时样品中补骨脂素、异补骨脂素的含量无明显差别，故选用超声提取40 min。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京:化学工业出版社，2005:129、130.

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