免疫磁珠捕获结合荧光PCR技术检测食品中黄曲霉菌的研究

苏惠玉，谢荣珍，牛建军

(1.厦门医学高等专科学校，福建 厦门 361008；2.厦门市疾病预防控制中心，福建 厦门 361021)

免疫磁珠捕获结合荧光PCR技术检测食品中黄曲霉菌的研究

苏惠玉1，谢荣珍2，牛建军2

(1.厦门医学高等专科学校，福建 厦门 361008；2.厦门市疾病预防控制中心，福建 厦门 361021)

目的：研究利用免疫磁珠对食品中黄曲霉菌进行捕获的技术，为检测食品中污染的黄曲霉菌提供新方法。方法：应用山羊抗黄曲霉菌血清的免疫磁珠捕获食品中的黄曲霉菌，不需要进行增菌培养，应用磁捕获-荧光聚合酶链式反应(IMC-FPCR)技术快速检测鉴定食品中的黄曲霉菌。结果：IMC-FPCR方法检测黄曲霉菌的最低检测值为2CFU/mL。应用IMC-FPCR对从市场上购买的12种食品进行检测，发现有两份样品含有产毒素相关基因(即为可能的致癌菌株)，检出率为16.7%，其中花生中检出1株黄曲霉菌，面线中检出1株黄曲霉菌。结论：建立了黄曲霉菌的磁捕获-荧光聚合酶链式反应(IMC-FPCR)方法，该方法可用于食品中黄曲霉菌的快速检测及鉴定，实物检测结果提示市场上食品有被真菌污染。

黄曲霉菌；免疫磁珠；荧光PCR；快速检测

一些有害真菌在其生长发育过程中，可破坏食物结构，造成食物营养损耗，形成有毒有害产物(真菌毒素)，常引起人类的急慢性食物中毒，甚至诱导基因突变和导致恶性肿瘤。产毒真菌在自然界分布广、数量大、种类多，每年由此造成的食物损失达5%～10%[1-3]；产生的真菌毒素大多为分子量较小的有机化合物，稳定性强、毒性大，由真菌毒素污染食物及饲料后，通过直接或间接途径进入人类食物链所造成的危害就更难以估计了[4-5]。在所有真菌中，由黄曲霉产生的黄曲霉毒素的毒性危害最大，致癌力最强，可导致肝癌、胃癌和结肠癌等，已在粮食、油料作物种子、水果、干果、蔬菜、调味品、烟草、乳类、乳制品、肉类、鱼虾类、发酵产品和饲料中均发现有黄曲霉毒素[1-7]。致癌真菌在自然界分布较广，常常存在于土壤和其他基质中，并能随之污染粮食、油料作物的种子、食品和饲料等。致癌真菌的存在不仅严重影响人类自身的健康，而且严重危害一个国家或地区的食品和饲料行业的发展。粮食、食品和饲料一旦被致癌真菌污染，即使未能从样品中检出真菌毒素，仍存在导致恶性肿瘤的潜在危险[6-7]。

对于食品中致癌真菌的研究，国内外仅有少量文献报道。如致癌真菌产毒菌株的鉴定多采用待检菌株产毒培养后经薄层层析法测定其产毒能力，这种方法需要较完善的实验条件，操作较为繁琐，所需时间较长，进行大量检测时无法满足需要[6-7]。本研究应用山羊抗黄曲霉菌血清和免疫磁珠制备黄曲霉菌免疫磁珠，用于捕获食品中的黄曲霉菌，不需要进行增菌培养，建立黄曲霉菌的磁捕获-荧光聚合酶链式反应(IMC-FPCR)快速检测及鉴定方法，该方法灵敏度高、简便快速，对于防范及控制真菌性食源性疾病有着重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米粉、面线、南瓜面、番茄面、贡菊花、红豆、花生、葡萄干、银鹭花生牛奶、厦门即食面、大米、花椒12种实物均购于厦门市。

普通营养肉汤、琼脂粉 北京陆桥技术有限责任公司；Power SYBR Green PCR Master Mix 美国Applied Biosystems公司；山羊抗黄曲霉菌IgG UniQ免疫磁珠北京百奥科生物技术有限公司；乳酸石炭酸棉蓝染色液青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.2 菌种与培养基

黄曲霉GIM3.461(编号AS3.3928)、黄曲霉GIM3.18 (编号IMAS4076)、大肠杆菌GIM1.153(编号0157C83729)广东省微生物研究所菌种保藏中心。

察氏琼脂培养基、孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.3 仪器与设备

REVCO plus-86C型超低温冰箱 美国Revco公司；1-15K型台式小型低温离心机 美国Sigma公司； 7300型荧光定量PCR仪 美国ABI公司；MPC-S型磁架Dynal Biotech公司。

1.4 方法

1.4.1 真菌培养

无菌称取实物样品25g，加入225mL无菌生理盐水，均质混匀，制备成为10-1、10-2、10-3共3个梯度的样品稀释液，各梯度吸取1mL接种于培养皿，分别使用察氏琼脂培养基、孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)进行培养，且每个稀释度做两个平行，28℃培养5d，观察记录菌落生长状态[8-9]。

1.4.2 免疫磁珠捕获方法的建立

在无菌操作条件下，用移液枪移取1mL以上用察氏液体培养基摇培的黄曲霉菌标准菌株培养液于1.5mL的小管中，利用台式小型低温离心机于10000r/min离心20min，弃液体，沉淀重悬于1.0mL的PBS缓冲液中，再加入0.1mL的免疫磁珠悬液，室温下于摇床上100r/min轻缓旋转30min，完成后再将小管置于磁架上5min，在磁架上小心地移出管中液体，取出小管加入1mL PBST洗液，混匀，置于磁场架上5min，再移出洗液，重复清洗3次，移出洗液后再加入0.1mL的PBS重悬液，使吸附黄曲霉菌的磁珠重悬其中，将一部分带有黄曲霉菌的磁珠悬液的小管倒入已经过高温灭菌过的培养皿中，再倒入冷却至50℃左右的PDA培养基，混匀，置于28℃培养箱中培养[10-11]。

1.4.3 IMC-FPCR检测黄曲霉菌

采用液氮研磨的方法破壁，用CTAB方法(100μL CTAB提取液[10-11]：质量浓度2mg/100μL CTAB，1.4mol/L NaCl溶液，体积分数0.2% β-巯基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl、pH8.0)提取已破壁的菌体DNA。针对免疫磁珠捕获分离的真菌，以标准菌株黄曲霉为阳性对照，大肠杆菌为阴性对照，以无菌水为空白对照，20μL PCR体系为2×Power SYBR Green PCR Master Mix 10μL、20mmol/L正反向引物各0.5μL、DNA 2μL、无菌水7μL。荧光PCR扩增程序为50℃反应2min；95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃反应1min，40个循环；同时在荧光PCR仪上设置记录60℃到95℃的熔解曲线。正反向引物依据黄曲霉和寄生曲霉的产毒相关基因保守区序列设计，具体序列如下：Afa-F(5'-C G T T G G C G C G C T T G T T A C-3')，A f a-R(5'-CGCCCCGATCATTATTTACG-3')，由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.4.4 IMC-FPCR检测灵敏度

吸取0.5mL黄曲霉菌标准菌液于4.5mL的无菌水，依次类推分别稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度水平，取稀释度的菌液各1mL，按前述方法进行免疫磁捕获和荧光PCR检测；另取稀释度的菌液各1mL接种于PDA培养基，于28℃的恒温箱中培养，进行菌落计数[10-11]。

1.4.5 IMC-FPCR法检测实物样品

无菌称取样品25g，加入225mL灭菌生理盐水，均质混匀，取1mL于1.5mL的离心管中，经1500r/min离心3min使非菌体固形物沉淀，吸取上清液(含有未能沉淀的菌体)弃沉淀(实物中的固形物)，于10000r/min离心20min，弃上清液，加入1.0mL的PBS缓冲液，悬浮沉淀的菌体，混匀，再加入0.1mL的免疫磁珠悬液，室温下于摇床上100r/min轻缓旋转30min使菌体结合吸附于免疫磁珠上，完成后再将小管置于磁架上5min，在磁架上小心地移出管中液体，取出小管加入1mL PBST洗液混匀，置于磁架上5min，移出洗液，重复清洗3次，

移出洗液后再加入0.1mL的PBS重悬液使吸附黄曲霉菌的磁珠重悬其中。重悬液按1.4.3节方法进行样品DNA的提取，然后利用荧光PCR进行检测，并用黄曲霉菌标准菌株作阳性对照、大肠杆菌作阴性对照、水作空白对照[12-14]。

2 结果与分析

2.1 食品中真菌的培养结果

从食品中培养得到的真菌见图1，在培养基上的菌落特征为圆形凸翘，表面黄色，毡状，边缘不规则。

图1 食品中真菌的察氏平板培养情况Fig.1 Growth status on Czapek's plate of the fungal stain isolated from commercial foods tested

2.2 免疫磁珠捕获目的菌结果

以黄曲霉菌标准菌株作为测试菌株，应用制备的黄曲霉免疫磁珠捕获目的菌，并在PDA培养基中培养，结果见图2。菌落长势良好。大小为3～6cm，菌落呈圆形，表面黄色，毡状，边缘不规则。

图2 利用免疫磁珠捕获并在PDA培养基中培养的黄曲霉菌GIM3.461Fig.2 Growth status on PDA plate of Aspergillus flavus reference strain captured with the immunomagnetic beads coated with goat antiserum against Aspergillus flavus

2.3 荧光PCR法检测目的菌结果

以黄曲霉菌标准菌株作为测试菌，应用制备的黄曲霉免疫磁珠捕获目的菌，并采取反复冻融破壁和煮沸法获取黄曲霉菌的DNA，并利用荧光PCR进行检测，结果见图3。通过观察PCR扩增的曲线图和PCR反应的循环阈值(cycle threshold，Ct)来判断菌株的致癌性(以Ct值小于29为阳性，大于29或“不能检出”为阴性来进行判断)，对两株黄曲霉菌标准菌株均显示阳性结果，同时对空白对照(水)和大肠杆菌均显示阴性结果。扩增结果的熔解曲线如图4所示，两株黄曲霉标准菌的扩增产物均在83℃左右出现单一的熔解峰，而阴性对照和空白对照的扩增产物均没有出现熔解峰，表明了反应的特异性很高。两种标准黄曲霉菌株(黄曲霉GIM3.461；黄曲霉GIM3.18)在方法建立过程中结果一致，因此，在后续实验中选用了GIM3.461作为阳性对照。

图3 利用荧光PCR对黄曲霉菌标准菌株进行扩增的曲线图Fig.3 Real-time PCR amplification curves of Aspergillus flavus reference strains GIM 3.461 and 3.18 and Escherichia coli GIM 1.153

图4 黄曲霉菌标准菌株的扩增产物的熔解曲线Fig.4 Melting curves of real-time PCR amplification products from Aspergillus flavus reference strains GIM 3.461 and 3.18 and Escherichia coli GIM 1.153

2.4 灵敏度实验结果

图5 IMC-FPCR应用于检测梯度稀释的黄曲霉GIM3.461的结果Fig.5 Real-time PCR amplification curves obtained in the detection of gradient dilutions of Aspergillus flavus reference strain GIM 3.461 by the IMC-FPCR assay

表1 梯度稀释的黄曲霉菌GIM3.461利用荧光PCR扩增的Ct值Table 1 Ct values of real-time PCR amplification products of gradient dilutions of Aspergillus flavus reference strain GIM 3.461

标准黄曲霉菌经28℃培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度3个平板上的菌落平均数，其中稀释度为10-5的黄曲霉菌数为92CFU/mL，稀释度为10-6的菌数为9CFU/mL，稀释度为10-7的菌数为2CFU/mL，而荧光PCR的检测结果见图5和表1，对10-1～10-7倍稀释菌液检测均显示阳性，对10-8和10-9倍稀释菌液检测显示阴性，因此，IMC-FPCR方法检测黄曲霉菌的最低检测值为1CFU/mL。扩增产物在85℃左右有熔解峰，并且只有单一的熔解峰，表明反应的特异性很高。

2.5 IMC-FPCR法检测实物样品结果

图6 IMC-FPCR应用于检测实物样品中黄曲霉菌试验结果Fig.6 Real-time PCR amplification curves obtained in the detection of Aspergillus flavus in 3 real food samples by the IMC-FPCR assay

图7 利用荧光PCR对实物样品进行扩增的熔解曲线Fig.7 Melting curves of real-time PCR amplification products from Aspergillus flavus in 3 real food samples

在确立了黄曲霉菌免疫磁珠捕获黄曲霉菌以及荧光PCR检测的基础上，将随机从市场和超市采集的米粉、面线、南瓜面、番茄面、贡菊花、红豆、花生、葡萄干、银鹭花生牛奶、厦门即食面、大米、花椒1 2种实物样品，以IMC-FPCR方法进行黄曲霉菌检测，其中以Ct值小于29为阳性，大于29、Undet为阴性来进行判断，结果见图6和表2。从12份受检样品中分离出24份样品液，其中有两份样品检测为阳性，检出率为16.7%。其中花生中检测出含有1株黄曲霉菌，面线中检测出有1株黄曲霉菌。由图7可知，扩增产物在85℃左右有熔解峰，并且只有单一的熔解峰，表明了反应的特异性很高。

表2 实物样品利用荧光PCR扩增的Ct值Table 2 Ct values of real-time PCR amplification products from Aspergillus flavus in real food samples

3 结 论

本研究建立了利用免疫磁珠对食品中黄曲霉菌进行捕获并结合实时荧光PCR技术进行检测(IMC-FPCR)。免疫磁珠法是基于抗原抗体反应和磁分离技术，将制备好的黄曲霉菌免疫磁珠直接加至检样中，黄曲霉菌将被吸附在磁珠的抗体上，在磁场的作用下与其他微生物和样品残渣分离开来，从而直接捕获检样中的黄曲霉菌，不需要增菌培养，经荧光PCR检测证实，免疫磁珠从检样中直接分离和富集真菌，该方法简便、快速、可实现大批量检测[10-11]。敏感度是检测方法是否成熟有效的

重要指标[13-14]，本实验以黄曲霉菌标准菌株作阳性对照、大肠杆菌作阴性对照、水作空白对照进行了多次重复实验，确定了Ct值阳性、阴性判断界限值取29，小于29为阳性，大于29或“不能检出”为阴性的判定标准，以及IMC-FPCR法对黄曲霉菌的检测低限为2CFU/mL。结果表明，建立的IMC-FPCR法抗干扰性强，免疫磁珠方法直接从检样中捕获靶物质，去除了PCR抑制物；同时由于荧光PCR特异性扩增黄曲霉菌DNA，免疫磁珠吸附的包括黄曲霉菌在内的其他细菌不会干扰荧光PCR，IMC-FPCR解决了干扰及抑制问题。对12种食品检样利用IMC-FPCR方法进行检测，其中有两份样品检出被真菌污染，还提示了市场上食品可能存在被真菌污染的现象。

本研究在分析比较真菌产毒素相关基因的基础上，依据黄曲霉毒素相关基因的保守区序列设计了检测黄曲霉菌基因的引物，应用山羊抗黄曲霉菌血清和免疫磁珠制备黄曲霉菌免疫磁珠，用于捕获食品中的黄曲霉菌，不需要进行增菌培养，建立了黄曲霉菌的磁捕获-荧光聚合酶链式反应快速检测及鉴定方法。该方法灵敏度高、选择性好、简便，可在一个工作日内完成检测。

[1]唐为民, 呼玉山. 粮食、油料中产毒真菌及致癌性真菌毒素[J]. 粮食流通技术, 2002(6): 43-45.

[2]孙武长, 刘桂华, 杨红, 等. 粮食中真菌及真菌毒素污染调查[J]. 中国公共卫生, 2005, 21(12): 1532.

[3]魏建华. 玉米中真菌的分离和鉴定[J]. 中兽医医药杂志, 2001(6): 16-17.

[4]PETZINGER E, WEIDENBACH A. Mycotoxins in the food chain: the role of ochratoxins[J]. Livestock Production Science, 2002, 76(3): 245-250.

[5]PETZINGER E, ZIEGLER K. Ochratoxin A from a toxicological perspective[J]. Vet Pharmacol, 2000, 23(2): 91-98.

[6]STUDER-ROHR I, DIETRICH D R, SCHLATTER J, et al. Th e occurrence of ochratoxin in coffee[J]. Food Chem Toxicol, 1995, 33(5): 341-355.

[7]CHU P T, HSIEH M F, YIN S Y, et al. Development of a rapid and sensitive immunomagnetic-bead based assay for detecting Bacillus cereus in milk[J]. Eur Food Technol, 2009, 229(1): 73-81.

[8]GB/T 4789.1—2003食品卫生微生物学检验: 总则[S].

[9]GB/T 4789.15—2003食品卫生微生物学检验: 霉菌和酵母计数[S].

[10]刘光明, 苏文金, 蔡慧农, 等. 空肠弯曲菌的快速检测方法研究与应用[J]. 应用与环境生物学报, 2005, 11(6): 772-775.

[11]谢荣珍, 刘光明, 张明河, 等. 厦门市主要食品中致癌真菌污染的检测[J]. 实用预防医学, 2008, 15(5): 1347-1350.

[12]王传得, 郑晶, 黄晓蓉, 等. 黄曲霉DNA提取及PCR-RFLP检测方法的建立[J]. 食品科学, 2008, 29(12): 393-396.

[13]RUSSELL R, PATERSON M. Identification and quantification of mycotoxig- enic fungi by PCR[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(7): 1467-1474.

[14]MANONMANI H K, ANAND S, CHANDRASHEKAR A, et al. Detection of aflatox-igenic fungi in selected food commodities by PCR[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(8): 2859-2864.

Immunomagnetic Capture-Fluorescent PCR (IMC-FPCR) for Rapid Detection of Aspergillus flavus in Foods

SU Hui-yu1，XIE Rong-zhen2，NIU Jian-jun2
(1. Xiamen Medical College, Xiamen 361008, China；2. Center for Disease Prevention and Control of Xiamen City, Xiamen 361021, China)

An immunomagnetic bead based technique combined with fluorescent PCR assay was developed for the detection of Aspergillus flavus in foods. Aspergillus flavus in foods could be captured with the immunomagnetic beads coated with goat antiserum against Aspergillus flavus without the requirement for fungal enrichment and rapidly detected by fluorescent PCR assay. The IMC-FPCR assay exhibited a limit of detection of 2 CFU/mL. Two of 12 commercial food samples were detected by the IMC-FPCR assay to contain toxin genes from carcinogenic fungal strains and the detection rate was 16.7% and one Aspergillus flavus strain was detected in peanut and Xiamen ready-to-eat noodles, respectively. This assay is most suitable for the rapid detection of Aspergillus flavus in foods.

Aspergillus flavus；immunomagnetic beads；fluorescent PCR；rapid detection

TS207.4

A

1002-6630(2010)10-0287-05

2010-02-15

厦门市科技计划项目(3502Z20064028)

苏惠玉(1964—)，女，讲师，本科，主要从事医学护理研究。E-mail：chn@jmu.edu.cn