超临界CO2状态下生物酶法催化合成植物甾醇酯

王腾宇，胡立志，孙 博，刘 晶，于殿宇,*

(1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨 150030)

超临界CO2状态下生物酶法催化合成植物甾醇酯

王腾宇1，胡立志2，孙 博1，刘 晶1，于殿宇1,*

(1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨 150030)

对葵花油与植物甾醇在CO2超临界状态下合成植物甾醇酯的工艺进行研究。采用Novozym 435脂肪酶做催化剂，进行酯化反应。通过单因素与正交试验，确定了最佳工艺条件：反应温度85℃、植物甾醇质量分数5%、反应压力8MPa、反应时间1h、搅拌速度600r/min，在此条件下，转换率为92.1%。与常规方法相比，本工艺降低了反应温度，缩短了反应时间。

植物甾醇；葵花油；超临界CO2；酯化反应；脂肪酶

甾醇是甾族化合物其中的一类，由于其常态为固态所以又被称作固醇，主要以游离、高级脂肪酸酯、苷这三种形式存在于动物、植物和微生物体内。至今已发现100多种植物甾醇，含量较丰富的主要有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇[1-2]。

相关研究表明，植物甾醇可以有效地降低血液中的胆固醇含量，从而降低心脑血管疾病的产生，是一种行之有效的保健食品。植物甾醇具有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗氧化和抗炎等功效，被广泛应用于制药、保健品、化妆品、动植物生长激素以及化工、纺织等各领域[3-6]。国际营养学会推荐的未来十大功能性营养成分中就包括植物甾醇[7]。

虽然植物甾醇具有降低血清胆甾醇水平的功效，但游离植物甾醇在水和油脂中的低溶解性限制了它在食品中的实际作用[8]。植物甾醇酯在植物油脂中的含量非常少，但是植物甾醇酯具有更优的脂亲和性和更佳的降胆固醇效果[9]。这不仅方便甾醇在含脂食品中的传递，生物利用率高，溶解度好，还可以改善产品的外观及口感，因此备受青睐。临床试验表明，成人每天只要摄入1.3g以上植物甾醇酯即可达到降低胆固醇的目的[10-11]。

通常，甾醇酯是通过相应的甾醇与脂肪酸酯化、脂肪酸甲酯或三酰甘油酯交换、脂肪酸卤化物或脂肪酸酐反应来制取[12-13]。Katsunori等[14]、裘爱泳等[15]分别采用脂肪酶催化甾醇与不饱和脂肪酸在含水的溶剂体系中反应生产甾醇酯，关于植物油脂与植物甾醇在无溶剂体系中反应合成植物甾醇酯的研究尚未见诸报导。本研究对超临界CO2条件下葵花油和植物甾醇发生酯交换反应合成植物甾醇酯的方法进行探索，考察超临界CO2流

体下，反应温度、甾醇质量分数、反应压力、反应时间、搅拌速度对酯交换反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

植物甾醇 西安蓝天生物工程有限责任公司；葵花油 大连圣基生物制品有限公司；Novozym 435脂肪酶丹麦Novozymes公司；二氧化碳(纯度≥99.9%) 哈尔滨黎明气体有限公司；其他试剂均为化学纯。

高压反应釜 大连通达反应釜厂；恒温水浴锅 上海申生科技有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英峪高科仪器厂；LD4-2A低速离心机北京医用离心机厂；XW-80A旋涡混合器 上海青浦沪西仪器厂；722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物甾醇酯的合成

精确称量一定量的植物甾醇、葵花油和Novozym 435脂肪酶，连同转子一同加入150mL高压反应釜中。将高压反应釜密封，通入CO2进行密闭性测试，再次通入CO2置换高压反应釜中的空气3～5次，最后通入CO2并调整压力。将高压反应釜置于集热式磁力搅拌器中，调整温度、搅拌速度，反应一定时间。反应完成后，将高压反应釜取出并冷却至室温，排出反应釜内空气。取出产品，在3000～4000r/min条件离心20min，取出上层油脂制品。

1.2.2 标准曲线的制作

将甾醇溶解于乙酸酐中，配制成质量浓度为100 μg/mL的溶液并吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL分别置于10mL试管内，在各管内加入乙酸酐使总体积均达到4mL。加入2滴浓硫酸，30min后，在660nm波长处比色。以胆固醇质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，得出标准曲线。

1.2.3 转换率的测定

将制取的植物甾醇酯3～4滴，置于25mL试管内，准确记录其质量。加入4mL无水乙醇，0.5mL 50%氢氧化钾溶液，在65℃恒温水浴中皂化1h。皂化时每隔20～30min振摇一次使皂化完全。皂化完毕，取出试管，冷却。加入3mL 5%氯化钠溶液，10mL石油醚，盖紧玻塞，在电动振荡器上振摇2min，静置分层(约需1h以上)。

取上层石油醚液2mL，置于10mL试管内，在65℃水浴中用氮气吹干，加入4mL乙酸酐，2滴浓硫酸，混匀，静置20min后在660nm波长下比色，测得吸光度，在标准曲线上查出相应的植物甾醇含量。

式中：X为转换率/%；m为测得的吸光度在胆固醇标准线上显示的胆固醇含量/μg；V为石油醚总体积/ mL；V1为取出的石油醚体积/mL；m1为称取油样品脂量/g；m2为称取油脂中植物甾醇量/mg；m3为油脂制品量/g；m4为添加的植物甾醇量/mg；1/1000000为折算成每1g油脂制品植物甾醇酯毫克数。

1.2.4 各影响因素的分析与数据优化

通过单因素试验分析反应温度、植物甾醇质量分数、反应压力、反应时间以及搅拌速度对合成植物甾醇酯转换率的影响，并采用正交助手软件进行数据处理，分析得出最佳合成条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 反应温度对转换率的影响

图1 反应温度对转换率的影响Fig.1 Effect of reaction temperature on conversion rate

反应温度是影响转换率的一个主要因素。在甾醇质量分数10%、反应压力8MPa、反应时间3h、搅拌速度300r/min、酶用量1%(m/m)条件下，考虑不同温度对植物甾醇转换率的影响。从图1可以看出，在55～85℃这一区间内，随着温度的增加，转换率逐渐增加；再提高温度，转换率并未增加，且呈下降趋势。所以，选择反应温度为85℃。

2.1.2 甾醇质量分数对转换率的影响

植物甾醇质量分数是影响转换率的一个重要因素。在反应温度85℃、反应压力8MPa、反应时间3h、搅拌速度300r/min、酶用量1%条件下，考虑不同植物甾醇含量对转换率的影响。反应需要足够的反应物，若植物甾醇过少则反应不完全；若植物甾醇过多则不能够很好地溶解于葵花油中，不仅转换率不高，而且造成原料的浪费。从图2可以看出，随着植物甾醇质量分数

的增加，转换率明显下降。所以，选择甾醇质量分数为5%。

图2 植物甾醇质量分数对转换率的影响Fig.2 Effect of phytosterol concentration on conversion rate

2.1.3 反应时间对转换率的影响

图3 反应时间对转换率的影响Fig.3 Effect of reaction time on conversion rate

反应时间是影响植物甾醇酯交换反应的另一主要因素。反应的时间过短，酯交换反应不完全；反应时间过长，影响其品质，并且会造成资源的浪费。在反应温度85℃、甾醇质量分数5%、反应压力8MPa、搅拌速度300r/min、酶用量1%条件下，考虑不同反应时间对转换率的影响。从图3可以看出，随着时间的增加，转换率上升，但反应时间超过1h后，转换率提高缓慢。为了保证产品的质量和节约资源，选择反应时间1h。

2.1.4 反应压力对转换率的影响

图4 反应压力对转换率的影响Fig.4 Effect of reaction pressure on conversion rate

压力也是超临界酯交换反应的又一主要影响因素，压力的高低直接会影响到高压反应釜中反应物的传质速度。压力增大会很大程度上增加植物甾醇的溶解度，使其与葵花油在脂肪酶的催化下与催化剂充分接触，从而促进酯交换反应的发生，提高转换率。在反应温度85℃、甾醇质量分数5%、反应时间1h、搅拌速度300r/min、酶用量1%条件下，考虑不同反应时间对转换率的影响。从图4可以看出，反应压力在8MPa时转换率达到最大，再提高反应压力转换率提高不大，并且压力对超临界设备的要求非常高，过高的压力会增加设备的成本，从经济角度来看，选择8MPa为最佳反应压力。

2.1.5 搅拌速度对转换率的影响

图5 不同搅拌速度对转换率的影响Fig.5 Effect of stirring speed on conversion rate

搅拌可以增加催化剂与反应物的接触机率，有利于酯交换反应进行。在反应温度8 5℃、甾醇质量分数5%、反应压力8MPa、反应时间1h、酶用量1%的条件下，考虑不同搅拌速度对转换率的影响。从图5可以看出，随着搅拌速度的增加，转换率呈上升的趋势。但是，由于实验室条件所限，选择搅拌速度600r/min为最佳条件。

2.2 植物甾醇酯合成正交试验

根据单因素试验的结果，得出影响酯交换反应的主要因素，即反应温度、甾醇质量分数、反应压力、反应时间。选用L9(34)正交表进行正交试验，搅拌速度为600r/min，酶用量1%，确定最佳反应条件，以得到转换率较高的油脂制品。因素水平表见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

从表2可以看出，各因素对甾醇酯交换反应的影响主次顺序为：甾醇质量分数＞反应温度＞反应压力＞反

应时间，A2B1C3D3为最佳条件，即反应温度85℃、甾醇质量分数5%、反应压力9MPa、反应时间2h。按照此条件进行试验，得到的转换率为92.6%。但是，由于压力越高对设备的要求就越严格，并且单纯的延长反应时间对转换率的提高并不显著，从节省能源，高效低耗的角度考虑，选择最佳反应压力为8MPa、反应时间为1h。在此条件下，转换率为92.1%。

表2 正交试验设计及结果Table2 Design and results of orthogonal experiments

3 结 论

本实验将超临界CO2流体应用于葵花油与植物甾醇的酯交换反应中，结果表明：酶添加量的不同对转换率的影响与常压下合成植物甾醇酯相比较变化不大。植物甾醇酯的转换率随着压力的升高而增加，但是达到8MPa以后，增长缓慢；甾醇质量分数是一个非常重要的影响因素；同时，反应温度、反应时间也对转换率有一定的影响。

通过单因素与正交试验，确定了酯交换反应的最佳工艺条件：反应温度85℃、植物甾醇质量分数5%、反应压力9MPa、反应时间2h、搅拌速度600r/min、酶用量1%。但是从有利于工业化生产的角度，选择反应温度85℃、植物甾醇质量分数5%、反应压力8MPa、反应时间1h、搅拌速度600r/min、酶用量1%，所得转换率92.1%。

本方法与常规合成法相比较，不仅降低了反应温度，而且提高了酯交换反应的速度，使反应时间相对常规方法合成的时间大大缩短。

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Lipase-catalyzed Synthesis of Phytosterol Ester in Supercritical CO2

WANG Teng-yu1，HU Li-zhi2，SUN Bo1，LIU Jing1，YU Dian-yu1,*
(1. College of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. National Research Center of Soybean Engineering & Technology, Harbin 150030, China)

In the supercritical CO2condition, the synthesis of phytosterol ester was investigated using sunflower oil and phytosterol as the materials and Novozym 435 lipase as the catalyst. The optimal esterification conditions were achieved through single factor and orthogonal experiments to be reaction temperature of 85 ℃, phytosterol concentration of 5%, reaction pressure of 8 MPa, reaction time of 1 h, stirring speed of 600 r/min, and lipase dosage of 1%. The conversion rate was up to 92.1% under the optimal reaction conditions. This study will provide a theoretical reference for the preparation of phytosterol ester.

phytosterol；sunflower oil；supercritical CO2；esterification；lipase

TS229

A

1002-6630(2010)22-0293-04

2010-03-20

2010黑龙江省教育厅科学技术研究项目(WB09B201-1)

王腾宇(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为粮油加工。E-mail：wangtengyu@yahoo.cn

*通信作者：于殿宇(1964—)，男，教授，硕士，研究方向为大豆油脂加工技术。E-mail：dyyu2000@yahoo.com.cn