微生物多糖韦兰胶生产工艺优化

赵 燕，陈 芳，李建科，廖 斌，涂勇刚

(1.南昌大学 生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；3.江西农业大学食品科学与工程学院，江西 南昌 330045)

微生物多糖韦兰胶生产工艺优化

赵 燕1,2，陈 芳1,2，李建科1,2，廖 斌1,2，涂勇刚3

(1.南昌大学 生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；3.江西农业大学食品科学与工程学院，江西 南昌 330045)

探讨韦兰胶的生产条件，主要包括生产菌株、发酵培养基及发酵工艺条件三方面。通过绘制菌体生长曲线，了解此菌种的生长情况，初步确定二级种子的培养时间。通过单因素试验及正交试验，得出韦兰胶的最佳发酵培养基配方为：蔗糖40g/L、酵母膏3g/L、K2HPO4·7H2O 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L；此条件下，韦兰胶产率由7.31g/L上升到17.23g/L。最佳发酵工艺条件为：接种龄18h、接种量0.5%、装液量40mL(250mL摇瓶)、初始pH7.0、摇床转速220r/min、培养温度30℃、培养时间72h，在此条件下，韦兰胶产率达20.64g/L。

微生物多糖；韦兰胶；发酵

微生物多糖是细菌、真菌等微生物在生长代谢过程中产生的生物聚合物[1]。与动植物多糖相比，微生物多糖生产周期短，受外界环境因素的影响相对较小，产量及质量都相对稳定，可以在控制条件的情况下实现工业化生产[2]。以高黏度、水溶性为特征的微生物胶是近年来利用现代生物技术开发的新型微生物多糖，可作为增稠剂、悬浮剂、黏附剂或保水剂，广泛应用于食品、医药、石油和水泥等领域，具有很高的商业价值，尤其是黄原胶、结冷胶和韦兰胶这3种微生物胶[3-4]。

韦兰胶(welan gum，welan，编号S-130)，也叫威兰胶、威伦胶或维兰胶，是Alcaligenes sp. ATCC 31555产生的胞外多糖，被认为是继黄原胶、结冷胶之后最具市场前景的第3代微生物胶。研究表明韦兰胶属于典型的假塑性流体，具有良好的增稠性、悬浮性、乳化性，尤其是具有耐高温、耐酸碱、耐盐性能[5-6]。韦兰胶水溶液对热稳定，在温度升高至149℃时，其黏度基本不变，其耐温极限值比黄原胶高20～30℃。韦兰胶水溶液对酸、碱稳定，其黏度在pH2～13范围内基本不受影响；对盐的稳定性也高，使其可作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和保水剂应用于工、农业生产的诸多方面。

国外早在20世纪80、90年代就开始研究韦兰胶的

结构、构象、性质和应用[5-18]，但未见对其发酵和生产方面的报道。我国于近年开始进行韦兰胶方面的研究[1,19-26]，韦兰胶摇瓶发酵的产率大多在17g/L左右，仅有少数报道其胶产率超过20g/L；上罐发酵韦兰胶的产率普遍高于摇瓶发酵的水平。但迄今为止，韦兰胶在国内还没有实现工业化生产，美国Kelco公司仍是全球惟一的韦兰胶生产供应商。本实验主要对韦兰胶生产菌株、发酵培养基配方及发酵工艺条件三方面进行探索性研究，以期为韦兰胶的进一步开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

菌株Alcaligenes sp. ATCC31555购于美国菌种保藏中心。

斜面培养基(g/L)：酵母粉3、蛋白胨4、KCl 5；种子培养基(g/L)：葡萄糖15、蛋白胨7、KCl 5；发酵培养基(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨3、CaCl20.5、FeSO4·7H2O 0.001、K2HPO4·7H2O 0.3、MgSO4· 7H2O 0.5。

1.2 仪器与设备

AR1140分析天平、SPS401F电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司；恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；303A-4数显电热培养箱 上海浦东荣丰科学仪器有限公司；净化工作台 上海新苗医疗机械制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯医疗设备厂；752N紫外-可见分光光度计、PHS-3B精密pH计上海精密科学仪器有限公司；电热鼓风干燥箱 南京实验仪器厂；Brookfield DV-Ⅱ+Pro 黏度计 美国Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 菌体生长曲线的绘制

250mL带挡板的摇瓶装液量50mL，接种量1%，220r/min、30℃振荡培养。在0、5、10、15、20、25h时分别取发酵液样品，测定菌体浓度(OD660nm)、总糖质量浓度、还原糖质量浓度，绘制生长曲线。

1.3.2 发酵培养基的筛选

1.3.2.1 单因素试验

培养基成分固定FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L，以韦兰胶产率为主要评价指标，发酵液黏度为参考指标，考察不同碳源、氮源、K2H P O4·7 H2O用量、MgSO4·7H2O用量对韦兰胶发酵的影响。

1.3.2.2 正交试验

固定培养基组分中FeSO4·7H2O 和CaCl2质量浓度分别为1mg/L和0.5g/L，在单因素试验的基础上，以蔗糖质量浓度(A)、酵母膏质量浓度(B)、K2HPO4·7H2O质量浓度(C)、MgSO4·7H2O质量浓度(D)为因素，各取3水平，以韦兰胶的产率为指标，进行正交试验。

1.3.3 发酵工艺条件优化

以韦兰胶产率为主要指标、发酵液黏度为参考，考察种龄及接种量、培养基装液量、初始pH值对韦兰胶发酵的影响。

1.3.4 培养方法

一级种子培养：250mL摇瓶内装50mL种子培养基，接种活化后的斜面菌种两环，摇床转速220r/min，培养温度30℃，培养时间24h。

二级种子培养：50mL种子培养基(250mL摇瓶)，接种量1%，转速220r/min，30℃培养15h。

发酵培养：将培养好的种子液按1%的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中培养、30℃，220r/min，培养72h。

1.3.5 测定方法

还原糖的测定：3,5-二硝基水杨酸(DNS)法；总糖的测定：苯酚-硫酸法；菌体生长量的测定：比浊法；发酵液酸度的测定：用pH计进行测定；发酵液黏度的测定：用黏度计(4号转子，转速60r/min)测定；韦兰胶胶产率的测定：采用乙醇沉淀法测定。称取适量发酵液，加入2倍体积的95%乙醇沉淀析出韦兰胶。过滤，烘干，称质量，提取的韦兰胶质量与发酵液体积之比即胶产率。

2 结果与分析

2.1 菌体生长曲线

图1 菌体生长曲线Fig.1 Growth curve of ATCC31555 in seed medium

由图1可知，菌种在经过10h的延滞期后到达对数生长期。15h后菌体生长较为稳定，20h后菌体生长进入衰亡期。最佳种龄一般处于对数生长期的末期，由此预测本实验菌种的最佳种龄(即二级种子培养时间)应该在15h左右。

总糖与还原糖的变化趋势与菌体的生长趋势保持一

致。在菌体生长的延滞期，总糖与还原糖质量浓度变化不大，进入对数生长期后，总糖与还原糖质量浓度都下降。但总体而言，在整个菌体生长过程中耗糖量不大，糖质量浓度不是该菌生长的主要限制性因素。

2.2 发酵培养基的筛选

2.2.1 单因素试验

2.2.1.1 碳源的选择

分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、木薯淀粉水解液作碳源进行摇瓶发酵实验，考察不同碳源对韦兰胶合成的影响。如图2所示，菌株在以蔗糖为碳源时发酵液的黏度与胶产率均最高，以葡萄糖或木薯淀粉水解液为碳源也可获得较高的胶产率，但发酵液黏度偏低。而在以可溶性淀粉为碳源时，菌株几乎不产胶，发酵液黏度和产胶率均为零，说明该菌水解可溶性淀粉的能力极低。实验结果表明蔗糖为最佳碳源。

图2 碳源对韦兰胶产率和黏度的影响Fig.2 Effect of carbon source on the yield and viscosity of Welan gum

2.2.1.2 氮源的选择

图3 氮源对韦兰胶产率和黏度的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on the yield and viscosity of Welan gum

分别采用蛋白胨、玉米浆、酵母膏、硝酸铵、硫酸铵、尿素作氮源，考察其对胶产率和发酵液黏度的影响。从图3可知，菌株在以酵母膏为氮源时，发酵液的黏度和胶产率均为最高；以蛋白胨或玉米浆为氮源也可获得较高的胶产率，但发酵液黏度明显偏低；以无机氮为氮源，胶产率和发酵液黏度均不理想。这可能是由于有机氮源比无机氮源营养成分丰富，可以提供发酵所需要的其他营养，如氨基酸和维生素等。

2.2.1.3 K2HPO4·7H2O用量的选择

磷有利于糖的代谢，因此它能促进微生物的生长繁殖；但当磷过量时，许多产物的合成又会受到抑制，故磷用量的选择非常必要。由图4可知，在K2HPO4·7H2O质量浓度0～10g/L的范围内，综合考虑韦兰胶产率和发酵液黏度，认为其在发酵培养基中的质量浓度以5g/L左右为宜。

图4 K2HPO4·7H2O质量浓度对韦兰胶产率和黏度的影响Fig.4 Effect of K2HPO4·7H2O concentration on the yield and viscosity of Welan gum

2.2.1.4 MgSO4·7H2O用量的选择

图5 MgSO4·7H2O质量浓度对韦兰胶产质量率和黏度的影响Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O concentration on the yield and viscosity of Welan gum

镁是许多重要酶的激活剂和启动器，因此其用量的选择也非常关键。由图5可知，M g S O4·7 H2O质量浓度为3g/L左右时韦兰胶产率最高，发酵液黏度适中。

2.2.2 正交试验

按1.3.2.2节设计进行正交试验，试验设计及结果见表1。

表1 正交试验设计及结果Table 1 Design and results of orthogonal experiments

表2 正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments

由表1可知，影响韦兰胶产率各因素的主次顺序为酵母膏质量浓度＞蔗糖质量浓度＞K2HPO4·7H2O质量浓度＞MgSO4·7H2O质量浓度。最佳培养基配方为A2B2C2D1，结合培养基中的固定组分FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L，即最佳培养基配方为：蔗糖40g/L、酵母膏3g/L、K2HPO4·7H2O 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L。按此配方进行验证实验，韦兰胶产率达17.23g/L。由表2方差分析可知，蔗糖和酵母膏质量浓度对胶产率的影响都具有显著性。

2.3 发酵工艺条件的优化

2.3.1 种龄及接种量的选择

图6 种龄对韦兰胶产率和黏度的影响Fig.6 Effect of seed age on the yield and viscosity of Welan gum

通常，接种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期后期，且培养液中菌体量将达到最高峰时较为合适；接种量的大小取决于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度[27]。本实验将种龄控制在12～24h，接种量控制在0.5%～4%的范围内，综合考察对胶产率和发酵液黏度的影响。结果如图6～7所示，最佳种龄为18h，最佳接种量为0.5%。综合图6与图1分析，种龄处于菌体对数生长后期有利于发酵生产；当种龄超过稳定期进入衰亡期后，韦兰胶的生物合成量下降。

图7 接种量对韦兰胶产率和黏度的影响Fig.7 Effect of inoculation amount on the yield and viscosity of Welan gum

2.3.2 装液量的选择

韦兰胶的发酵是好氧的，此类发酵过程中在没有自动控制溶氧系统的情况下通常采用较少装液量和提高摇床转速来控制溶氧。本实验将装液量控制在20、40、60、80、100mL(250mL摇瓶)，综合考察胶产率和发酵液黏度，结果如图8所示，最佳装液量为40mL。

图8 装液量对韦兰胶产率和黏度的影响Fig.8 Effect of medium volume on the yield and viscosity of Welan gum

2.3.3 初始pH值的选择

将培养基的初始pH值分别调节至5、6、7、8、9，分别进行摇瓶培养并测定韦兰胶的胶产率和发酵液黏度，结果如图9所示，培养基初始p H值对ATCC31555产胶和胶黏度都有明显的影响，较优的初始pH值为7。

图9 初始pH值对韦兰胶产率和黏度的影响Fig.9 Effect of initial pH on the yield and viscosity of Welan gum

3 结 论

以Alcaligenes sp. ATCC31555为生产菌株，通过对营养条件和环境条件的优化，确定最优的发酵培养基为：蔗糖40g/L、酵母膏3g/L、K2HPO4·7H2O 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L；验证实验表明，采用优化的发酵培养基，韦兰胶产率可达17.23g/L。最佳发酵环境条件为：接种龄18h、接种量0.5%、装液量40mL(250mL摇瓶)、初始pH7.0、摇床转速220r/min、培养温度30℃、培养时间72h；在此条件下，韦兰胶产率高达20.64g/L。

[1]贾薇, 郑志永, 刘汝冰, 等. 一种新型微生物多糖流变学初探[J]. 食品科学, 2009, 30(1): 135-138.

[2]李静, 连宾, 胡鹏刚. 细菌多糖及其在食品工业中的应用[J]. 食品科学, 2006, 27(4): 255-259.

[3]BAJAJ I B, SURVASE S A, SAUDAGAR P S, et al. Gellan gum: Fermentative production, downstream processing and applications[J]. Food Technology and Biotechnology, 2007, 45(4): 341-354.

[4]ROSALAM S, ENGLAND R. Review of xanthan gum production from unmodified starches by Xanthomonas comprestris sp.[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(2): 197-207.

[5]TAKO M, KIRIAKI M. Rheological properties of welan gum in aqueous media[J]. Biological Chemistry, 1990, 54(12): 3079-3084.

[6]CAMPANA S, ANDRADE C, MILAS M, et al. Polyelectrolyte and rheological studies on the polysaccharide welan[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 1990, 12(6): 379-384.

[7]JANSSON P E, LINDBERG B, WIDMALM G, et al. Structural studies of an extracellular polysaccharide (S-130) elaborated by Alcaligenes ATCC 31555[J]. Carbohydrate Research, 1985, 139(15): 217-223.

[8]JANSSON P, WIDMALM G. Welan gum (S-130) contains repeating units with randomly distributed l-mannosyl and l-rhamnosyl terminal groups, as determined by fabms[J]. Carbohydrate Research, 1994, 256 (2): 327-330.

[9]O NEIL M A, SELVENDRAN R R, MORRIS V J, et al. Structure of the extracellular polysaccharide produced by the bacterium Alcaligenes (ATCC 31555) species[J]. Carbohydrate Research, 1986, 147(2): 295-313.

[10]STANKOWSKI J D, ZELLER S G. Location of the O-acetyl group in welan by reductive cleavage method[J]. Carbohydrate Research, 1992, 224(2): 337-341.

[11]JOSEPH C, NIGEL S. Selective zonal isolation of oil wells: US, 5697441[P]. 1997-12-16.

[12]ROLS S, AMBROISE J. Effects of different viscosity agents on the properties of self-leveling concrete[J]. Cement and Concrete Research, 1999, 29(2): 261-266.

[13]LOPES L, ANDRADE C T, MILSA M, et al. Influence of aggregates on the sedimentation properties of welan gum[J]. Polymer Bulletin, 1995, 34(5/6): 655-662.

[14]PLANK J. Applications of biopolymers and other biotechnological products in building materials[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2004, 66(1): 1-9.

[15]SANDFORD P A, COTTRELL I W, PETTITT D J. Microbial polysaccharides: new products and their commercial applications[J]. Pure and Application Chemistry, 1984, 56(7): 879-892.

[16]LEE E J, CHANDRASEKARAN R. X-Ray and computer modeling studies on gellan-related polymers: Molecular structures of welan, S-657, and rhamsan[J]. Carbohydrate Research, 1991, 214(1): 11-24.

[17]HEMBER M W, RICHARDSON R K, MORRIS E R. Native ordered structure of welan polysaccharide: conformational transitions and gel formation in aqueous dimethyl sulphoxide[J]. Carbohydrate Research, 1994, 252: 209-221.

[18]MORRIS E R, GOTHARD M G, HEMBER M W, et al. Conformational and rheological transitions of welan, rhamsan and acylated gellan [J]. Carbohydrate Polymers, 1996, 30(2/3):165-175.

[19]李会, 李莎, 冯小海, 等. Alcaligenes sp. NX-3产威兰胶的补料分批发酵工艺研究[J]. 食品与发酵工业, 2009, 35(1): 1-4.

[20]LI Hui, XU Hong, XU Hao, et al. Biosynthetic pathway of sugar nucleotides essential for welan gum production in Alcaligenes sp. CGMCC2428 [J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2010, 86(1): 1-9.

[21]郭朝江. 低能N+注入威兰胶生产菌诱变选育及发酵工艺优化[D]. 南京: 南京工业大学, 2007.

[22]徐虹, 李莎, 郭朝江. 一种产碱杆菌及其在制备威兰胶中的应用: 中国, CN1888054[P]. 2007-01-03.

[23]李莎, 徐虹, 姜岷. 产碱杆菌NX-3胞外多糖的结构与性能[J]. 微生物学通报, 2005, 32(6): 37-41.

[24]郭建军, 李建科, 陈琳, 等. 韦兰胶生产菌的选育[J]. 食品工业科技, 2009, 30(2): 126-128.

[25]郭建军, 李建科, 陈芳, 等. 黄原胶和韦兰胶混胶粘度的影响因素研究[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 96-99.

[26]陈芳, 李建科, 徐昶. 新型微生物多糖: 韦兰胶的流变特性影响因素研究[J]. 食品科学, 2007, 28(9): 49-51.

[27]储炬, 李友荣. 现代生物工艺学[M]. 上海: 华东理工大学出版社, 2007: 122-123.

Fermentation Processing of Microbial Polysaccharide Welan Gum

ZHAO Yan1,2，CHEN Fang1,2，LI Jian-ke1,2，LIAO Bin1,2，TU Yong-gang3
(1. Engineering Research Center of Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Optimal preparation conditions such as strain, fermentation medium and fermentation processing parameters were explored. The growth of strain and second stage of seed were achieved by the growth curve of ATCC31555 in medium. The optimal fermentation medium for preparing Welan gum were explored by single factor and orthogonal experiments to be 40 g/L sucrose, 3 g/L yeast extract, 5 g/L K2HPO4·7H2O, 2 g/L MgSO4·7H2O, 1 mg/L FeSO4·7H2O and 0.5 g/L CaCl2. The yield of Welan gum was increased from 7.31 to 17.23 g/L by using the improved medium. The optimal fermentation conditions were the seed age of 18 hours, inoculation amount of 0.5% (V/V), medium volume of 40 mL in 250 mL flask, pH 7.0, shaking speed of 220 r/min, fermentation temperature of 30 ℃ and fermentation time of 72 h. Under the optimal fermentation conditions, the yield of Welan gum was up to 20.64 g/L.

microbial polysaccharide；Welan gum；fermentation

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0219-05

2010-08-15

食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题(SKLF-TS-200822)

赵燕(1980—)，女，助理研究员，博士，研究方向为农产品加工与生物质转化。E-mail：zhaoyan@ncu.edu.cn