响应面法优化固相微萃取-气质联用法检测鸭肉中挥发性风味物质

王 武，查甫本，张 静，沈君臣，任志伟

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

响应面法优化固相微萃取-气质联用法检测鸭肉中挥发性风味物质

王 武，查甫本，张 静，沈君臣，任志伟

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

为优化鸭肉中挥发性风味物质的萃取条件，在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，以鸭肉挥发性风味物质的色谱图总峰面积为响应值进行响应面分析。结果表明，最佳萃取条件为鸭肉萃取量为2.4g、萃取时间42min、萃取温度49℃。在此条件下检测到鸭肉中含有烯烃类、醛类、酮类、含氮含硫含氧类及杂环化合物等挥发性风味物质27种。

鸭肉；固相微萃取-气质联用法(SPME-GC-MS)；挥发性风味物质；Box-Behnken设计；响应面分析

鸭肉具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点，含有较多的B族维生素、VE和烟酸[1]，其脂肪酸熔点低，易于消化吸收。据《本草纲目》记载，鸭甘、大寒、无毒，有清肺解热、止咳化痰、养胃补肾、滋阴补血之功，可用于医治痨热骨蒸、血晕头痛、阴虚失眠、肺热咳嗽、肾炎水肿、排尿不利及低热等症，养生界也有“烂煮老雄鸭，功效比参芪”之说，食鸭进补也逐渐成为一大时尚。在禽畜制品市场竞争日趋激烈的形势下，保持鸭肉制品的风味是提高鸭肉制品竞争力的重要保证，而挥发性风味物质是影响鸭肉制品风味的重要方面。

固相微萃取技术(solid phase microextraction，SPME)是1989年加拿大Waterloo大学C.L.Arthur和 J.Pawliszyn等开发的新型无溶剂样品前处理技术，SPME技术集采样、萃取、浓缩、进样于一体，操作简便，广泛应用于环境污染物、农药残留、临床药理、公安案件分析、制药、化工、食品分析等领域[2]，可用于鸭肉挥发性风味物质检测的前处理。本实验通过Box-Behnken试验设计法及响应面分析法，优化了固相微萃取条件，并采用顶空固相微萃取与气相色谱联用技术，分析检测鸭肉挥发性风味成分，以期为确定其鸭肉特色挥发性风味物质产生机理并进一步为鸭肉风味调控研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

樱桃谷瘦型鸭腿 山东六和集团有限公司。

1.2 仪器与设备

手动SPME进样器、75μmCarboxen/PDMS萃取头、65μmPDMS/DVB萃取头，100μmPDMS萃取头、15mL EPA/VOA螺口样品瓶 美国 Supelco公司；DB-5MS毛细管色谱柱 Agilent公司；QP-2010气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司； 液氮罐 成都金凤液氮容器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萃取头老化

将使用的3种固相微萃头在气相色谱的进样口老化至无杂峰，老化温度250℃，时间120min。

1.3.2 样品制备

将生鸭肉在 95℃左右的水中煮熟后取腿肉，冷冻24h后切成薄片，迅速置于液氮罐中0.5h，磨成粉末备用。

1.3.3 GC-MS参数条件及分析

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：DB-5MS毛细管色谱柱(60m×0.32mm，1μm)；升温程序：起始柱温40℃，保持2min，以5℃/min上升至60℃；再以3℃/min上升至100℃；再以18℃/min上升至240℃，保持6min。载气He，流速0.3mL/min；恒压35kPa，不分流，进样口温度与接口温度均为250℃，检测温度240℃。

1.3.3.2 质谱条件

电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度200℃；灯丝电流150μA；质量扫描范围(m/z)33～450u。

1.3.4 定性定量方法

定性方法：经计算机检索，同时与NIST library对照相匹配，本研究仅报道相似度大于80(最大值100)的鉴定结果。

定量方法：相对百分含量按峰面积归一化计算。

1.3.5 试验设计

1.3.5.1 单因素影响试验

在固定的GC-MS条件下选择合适萃取头，再在此基础上考察萃取量、萃取温度、萃取时间、解析时间对萃取物质离子色谱图总峰面积的影响。

1.3.5.2 响应法试验设计

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计方案，选用最佳萃取头及解吸时间，以萃取量(A)、萃取时间(B)、萃取温度(C)为试验因素，并以+1、0、－1分别代表变量的水平，以总峰面积作为响应值。采用Design-Expert软件对试验数据进行回归分析和响应面分析。

1.3.5.3 样品检测

根据响应面设计确定的最优条件，对实际样品进行检测，对试验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 萃取条件优化

2.1.1 萃取头的选择

萃取头涂层种类和厚度对SPME灵敏度的影响最为关键，不同种类目标分析物一般需用不同类型的吸附质涂层萃取，考虑到被萃取的物质种类和极性都较多，需要对萃取头进行选择。固定鸭肉萃取量2g，分别选择在45℃恒温下萃取30min，解吸时间为2min，考察CAR/ PDMS、PDMS/DVB、PDMS 3种萃取头对总峰面积的影响，结果如图1所示。

图1 萃取头对总峰面积的影响Fig.1 Effect of extraction fibers on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

由图1可知，CAR/PDMS萃取头萃取得到的总峰面积远远大于PDMS/DVB萃取头和PDMS萃取头，可能是由于鸭肉中气体和小分子质量化合物较多，而CAR/ PDMS萃取头对一些气体及小分子物质萃取效果较好，因此萃取头类型选择CAR/PDMS。

2.1.2 萃取量对总峰面积的影响

由于瓶内容积固定，而鸭肉萃取量对挥发性成分的影响较大，量少则挥发性成分较少不易分析，量过多则由于挤压作用而使得气体不易挥发出来，选用CAR/ PDMS萃取头，固定萃取时间30min，萃取温度45℃，解吸时间2min，鸭肉萃取量分别为1、2、3、4g，研究萃取量对总峰面积的影响，结果如图2所示。

图2 萃取量对总峰面积的影响Fig.2 Effect of sample load on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

由图2可知，总峰面积随着鸭肉量的增大而增大，添加量为2g达到最大，然后则稍有减小。这表明鸭肉萃取量对总峰面积影响较大，并且存在最佳点。

2.1.3 萃取温度对总峰面积的影响

萃取温度对SPME的影响具有双重效应：通常升高温度，液体内分子热运动加快，有利于分析物在基质中的扩散(提高分析物在顶空的分配)，缩短平衡时间、加快分析速度；但温度过高会使分析物在涂层与基质中的分配系数降低，涂层对分析物的吸附量减小，影响SPME法的灵敏度。选择CAR/PDMS萃取头，固定萃取量2g，萃取时间30min，解吸时间2min，萃取温度设定为35、45、55、65℃，研究萃取温度对总峰面积的影响，结果如图3所示。

图3 萃取温度对总峰面积的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

由图3可知，总峰面积在45℃时达到最大，然后开始下降。这表明萃取温度对总峰面积的影响较大，并且存在最佳值。

2.1.4 萃取时间对总峰面积的影响

萃取时间的长短主要取决于顶空瓶中被分析物质在固-气二相之间达到平衡的速度，一般萃取过程均在刚开始时吸附量迅速增加，到一定的点位后上升就很缓慢。选择CAR/PDMS萃取头，固定萃取量2g，萃取温度45℃，解吸时间2min，萃取时间分别为20、30、40、50min，研究萃取时间对总峰面积的影响，结果如图4所示。

图4 萃取时间对总峰面积的影响Fig.4 Effect of extraction duration on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

由图4可知，随着时间的延长，总峰面积不断增大，40min时达到最大，随着时间的增加，面积反而有所减小。这表明萃取时间对总峰面积有影响较大，并且存在最佳值。

2.1.5 解吸时间对总峰面积的影响

解吸时间的长短一般和萃取头涂层的厚度有关，萃取头涂层越厚，解吸时间就相应地延长。选择CAR/ PDMS萃取头，固定萃取时间40min，鸭肉萃取量2g，萃取温度40℃，解吸时间分别为1、2、3、4min，研究解析时间对总峰面积的影响，结果如图5所示。

图5 解吸时间对总峰面积的影响Fig.5 Effect of desoprtion duration on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

由图5可知，随着解吸时间的增加，峰面积也在增大，但在解吸时间为2min之后峰面积基本不变，而且在解吸2min后，再重新插入进样口解吸，基本上没有任何信号。故解吸时间选择为2min。

2.2 响应面法优化萃取条件

2.2.1 响应面法因素水平的选取及试验方案

根据 Box-Behnken试验设计原理[3-4]，综合单因素试验结果，选择CAR/PDMS萃取头，解吸时间固定为2min，以鸭肉的萃取量、萃取时间及萃取温度作为研究因素，采用三因素三水平响应面分析方法，试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析试验因素水平表Table1 Factors and levels in the response surface design

2.2.2 多元回归结果分析

以总峰面积为响应值(Y)，对固相微萃取检测鸭肉挥发性风味物质进行响应面分析，试验设计为12个析因点和3个零点，其中析因点为自变量取值在各因素所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差。试验方案及结果见表2，回归分析结果见表3。

表2 设计方案和结果Table2 Response surface design arrangement and experimental results

表3 回归分析结果Table3 Results of regression analysis

利用Design Expert7.0软件对表2数据进行多元回归拟合，得到总峰面积对鸭肉萃取量(A)、萃取时间(B)和萃取温度(C)的二次多项回归模型：

Y=－4.88084+0.96642A+0.066833B+0.15835C－1.35×10-3AB－2.30×10-5AC－2.75×10-3BC－0.16654A2－7.72917×10-4B2－1.54295×10-3C2

由表3可知，回归模型极显著(P＜0.01)；而失拟项不显著(P=0.2493)，表明该模型拟合程度良好，可以用此模型来对鸭肉挥发性物质进行分析和预测。从表3可以看出，A、C、A2、B2、C2对结果的影响极显著(P＜0.01)。对总峰面积影响的大小依次为萃取量、萃取温度和萃取时间。

2.3 总峰面积的响应面分析与优化

图6 萃取量和萃取时间对总峰面积的影响Fig.6 Response surface diagram showing the interactive effects of sample load and extraction duration on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

图7 萃取量和萃取温度对峰面积的影响Fig.7 Response surface diagram showing the interactive effects of sample load and extraction temperature on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

图8 萃取时间和萃取温度对峰面积的影响Fig.8 Response surface diagram showing the interactive effects of extraction duration and temperature on total ion current chromatographic peak area of duck meat extract

利用Design Expert 7.0软件，绘制响应面图(在考察的区域内)，结果如图6～8所示。图6显示萃取温度为45℃条件下，萃取量和萃取时间对总峰面积的影响；图7显示萃取时间为40min情况下，萃取量和萃取温度对总峰面积的影响；图8显示萃取量为2g时，萃取时间和萃取温度对总峰面积的影响。比较3组图可知，萃取量和萃取温度对总峰面积的影响最为显著，表现为曲线较陡，而萃取时间则影响不大，表现为曲线较为平滑，响应值变化较小；且3个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，说明响应值存在极大值。结合二次回归模型的分析结果，最大总峰面积的萃取条件为鸭肉萃取量2.40g，萃取时间42.27min，萃取温度 49.17℃，此时，总峰面积最大，萃取效果最好。根据实际条件，选择鸭肉萃取量为2.4g， 萃取时间42min，萃取温度49℃。

2.4 样品的检测

图9 样品的分析谱图Fig.9 Total ion current chromatogram of duck meat extract

表4 鸭肉的挥发性风味成分和相对含量Table4 Identified flavor compounds and their relative content in duck meat

按上述最佳条件，即选用CAR/PDMS萃取头，鸭肉萃取量2.4g，萃取时间为42min，萃取温度为49℃，解吸时间固定为2min， 检测出鸭肉挥发性风味物质总峰面积为14928539。共检测出了烃类、醛类、醇类、酮类、酯类、含氮含硫含氧类及杂环化合物共27种风味物质。鸭肉的色谱图如图9所示，测定的风味物质的成分及相对含量如表4所示。

检测结果表明，烃类存在于鸭肉中，由于烷烃阈值较高，因此烷烃对于食品整体的风味贡献很小[5]。但一些支链烯烃，如3,4-二甲基-1-戊烯可能对鸭肉的香气特征有贡献。

从鸭肉中检出了大量的醛类物质，主要是己醛、戊醛、壬醛、辛醛等烷基醛和部分烯醛。烷基醛、烯醛和二烯醛是亚油酸酯和亚麻酸酯的氢过氧化物降解的产物，可能是构成肉品种的特征性风味物质[6]。一些相对分子质量低的醛类化合物对蒸煮以后鸭肉的特征香味有贡献[7]，己醛、壬醛、辛醛等具有清香青草气味[8-9]，一些烯醛类及二烯醛类化合物，如2-庚烯醛、2-辛烯醛对蒸煮以后肉的特征香味贡献更大。由于鸭肉不饱和脂肪酸含量较高，鸭肉的氧化产物对其风味的作用可能比其他肉类要大。

鸭肉中检出了1-戊醇、己醇等醇类物质，主要是在加热过程中脂肪氧化分解和羰基化合物还原所致，虽然这些醇类的阈值较高[10]，但鸭肉中饱和醇的百分含量为9.83%，含量较高，可能对鸭肉的特征风味有一定的贡献。

酮类可能是由不饱和脂肪酸的热氧化或降解产生的[11-12]，检测得到的酮类化合物中如2-庚酮、2,3-辛二酮、5-羟基-4-辛酮等对肉中甜的花香及果香风味有贡献，并且随着碳链的增长会呈现出更强的花香特征[13-14]。烯酮类化合物如3-甲基,4-己烯-2-酮、4-庚烯-2-酮等是在加热期间生成的脂质氧化的产物，具有植物芳香的气味特征。

Mottram[6]认为，杂环化合物及芳香类化合物域值较低，是肉中的特征香味的另一重要来源。2-戊基呋喃是亚油酸氧化产物，且阈值相对较低(大约为4μg/kg)，具有蔬菜芳香。2-戊基呋喃作为肉品脂质氧化的指示物可能对肉品的整体风味作用巨大[15]。含硫化合物是含硫氨基酸热降解产生的，在肉中大多数以很低的浓度存在，但是它们的阈值非常低并且具有重要的感官特性，所以对肉品风味的贡献很大。此外，茴香脑具茴香的特殊香气，而萜烯类的D-柠檬烯具有芬芳天然橙香味，留香时间长，它们可能对鸭肉的特色气味也产生重要的影响。

3 结 论

3.1 在单因素试验的基础上，应用Box-Behnken设计法和响应面分析法优化鸭肉挥发性风味物质的固相微萃取条件，并采用顶空固相微萃取与气相色谱联用技术检测分析鸭肉中的挥发性风味物质。最佳萃取条件为2.40g，萃取时间为42.27min，萃取温度为49.17℃，此时萃取总峰面积最大，萃取效果最好。实验过程中选择鸭肉萃取量为2.4g、萃取时间42min、萃取温度49℃。

3.2 鸭肉中的挥发性风味物质检测结果表明，鸭肉中共检测出烃类、醛类、醇类、酮类、酯类、萜烯类、呋喃类、含硫化合物等挥发性风味物质27种。

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Optimization of SPME-GC-MS Conditions for Flvour Compounds Determinationin in Duck Meat by Response Surface Analysis

WANG Wu，ZHA Fu-ben，ZHANG Jing，SHEN Jun-chen，REN Zhi-wei
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

To lay a foundation for the accurate determination of the flour compounds in duck leg meat by solid-phase microextraction (SPME) and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS), the optimization of the SPME conditions affecting the total ion current chromatographic peak area of duck meat extract was investigated using single factor and response surface methodology based on Box-Behnken central design. The optimal extraction conditions were obtained as follows: sample load 2.4 g and extraction temperature 49 ℃ for an extraction duration of 42 min. Totally 27 volatile flavor compounds were identified in duck meat. They were aldehydes, ketones and N-, S-, O containing and heterocyclic compounds.

duck meat；SPME/GC-MS；flavor compounds；Box-Behnken design；response surface methodology

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0329-06

2010-07-08

安徽省科技攻关重大项目(08010301080)

王武(1968—)，男，副教授，主要从事畜禽食品加工与副产物利用研究。E-mail：ww68@163.com