东海海参多糖酶解提取工艺优化

徐 逯，叶立斌，于 平，励建荣*

(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江 杭州 310035)

东海海参多糖酶解提取工艺优化

徐 逯，叶立斌，于 平，励建荣*

(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江 杭州 310035)

将现代酶解技术应用于东海海参多糖提取工艺，选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶进行酶解，通过单因素试验确定最佳蛋白酶为胃蛋白酶，并通过响应面分析方法以多糖得率为响应值优化酶解工艺。结果表明，酶解工艺最优条件为胃蛋白酶用量(m/m)0.95%、酶解温度56℃、酶解时间6h、酶解液pH1。在此条件下海参多糖得率为1.65%，该值与响应面模型的预测值1.59%基本相符。

东海海参；多糖；蛋白酶；响应面分析

东海海参(Acaudina molpadioides Semper)，又名海茄子，属于棘皮动物门(Echinodermata)，海参纲(Holothurioider)，生长于海洋底层岩石上或海藻间，为海洋中重要的食物和药物资源。其蕴藏量相当丰富，目前约为106吨。由于受加工技术的限制，东海海参深加工的产业链发展相对滞后，因而渔民即使捕获也放归大海[1]。研究表明，海参体壁所含的一种酸性黏多糖是一种有别于一般多糖类的含有糖醛酸和氨基糖残基的多糖[2]，海参黏多糖是一类高度硫酸酯化并经岩藻糖基侧链修饰的软骨素型聚糖[3]，海参酸性黏多糖具有降血压、抗癌作用[4-7]、提高机体细胞免疫功能[8-9]，对抗新生血管形成等[10-11]。因此，本实验对东海海参多糖的提取工艺进行研究，为进一步的海参酸性黏多糖提取打下基础。

以东海海参为原料，采用酶解技术，对酶解过程中的温度、时间、pH值、加酶量等条件进行研究，运用响应面分析法优化东海海参多糖提取工艺，为东海海参的进一步开发提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东海海参 宁海县东部海洋经济开发有限公司；胰蛋白酶(262U/g)、胃蛋白酶(3000～3500NFU/mg)、木瓜蛋白酶(52U/mg) Sigma公司。

1.2 仪器与设备

UV-2550型紫外-可见光分光光度计 Shimadzu公司；Forma-86C型超低温冰箱 Thermo Electron公司；DZG-6090型真空干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；高速离心机；Delta320型pH酸度计 Mettler Toledo公司；HH-2、HH-6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 东海海参酶解前处理工艺

工艺流程：东海海参→水发除盐→切碎→冷冻干燥→碱解→酶解→离心除沉淀→海参多糖酶解液

工艺要点：1)水发除盐：用自来水常温浸泡16h，使干海参膨胀，并使其所含盐分降低。2)切碎：东海海参表面积的大小会影响酶解效果，将东海海参切成块状即可。3)冷冻干燥：为计算精确的多糖得率，将原料冷冻干燥后进行酶解。4)碱解：以6倍0.5mol/L的K2CO3在60℃条件下碱解1.5h。5)酶解：加入一定量的蛋白酶，保持一定的酶解时间，通过苯酚硫酸法，以多糖得率为指标确定最佳酶解工艺。

1.3.2 酶水解工艺路线

将原料用粉碎机粉碎，取5g，以30mL 0.5mol/L K2CO3在60℃条件下碱解1.5h，然后用6mol/L HCl调pH值后进行酶解，以多糖得率为指标，分别改变溶液pH值、加酶量、温度、时间4个因素对蛋白酶的种类及各个条件进行优化。苯酚硫酸法[12]测定多糖含量，计算多糖得率。

1.3.3 多糖得率的计算

式中：多糖质量浓度通过苯酚硫酸法[12]测定。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类对酶解效果的影响

蛋白酶种类对糖蛋白的作用有一定影响，进而影响酶解效果。取相同量的东海海参粉末，在酶用量0.4%、温度50℃条件下酶解4h，考察不同蛋白酶对酶解效果的影响，结果见表1。

表1 蛋白酶种类对酶解效果的影响Table1 Effect of proteases on polysaccharide yield

由表1可见，在酶用量相同的情况下，以胃蛋白酶作用后的多糖得率为最高，可以达到1.2%，这是由于胃蛋白酶是一种酸性蛋白酶，能分解蛋白质中由芳香族氨基酸或酸性氨基酸所形成的肽键，故能催化酪蛋白、球蛋白、组蛋白，动物的角、指甲和羽毛中的角蛋白，以及催化植物蛋白等的水解，而胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键，重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制，木瓜蛋白酶对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质[13]。由于本实验所用原料为海产品，所以其中所含物质会对胰蛋白酶造成抑制，而木瓜蛋白酶的蛋白合成作用会对多糖得率有一定影响，所以有此确定蛋白酶的选取为胃蛋白酶，进而对其酶解条件进行进一步优化，以期达到最高得率。

2.2 酶解时间对胃蛋白酶酶解效果的影响

图1 酶解时间对多糖得率的影响Fig.1 Effect of hydrolysis duration on polysaccharide yield

由图1可知，随着酶解的进行，海参中的蛋白质不断降解为肽和氨基酸与糖链分离，多糖得率随之增加，但酶解时间过长会使酶解液腐败并使成本增加，理论上讲，在反应进行到一定程度后，随着底物减少，酶活力下降，酶解也会趋于平缓。因此，以多糖得率来确定最优酶解时间为6h。

2.3 酶用量对胃蛋白酶酶解效果的影响

图2 酶用量对多糖得率的影响Fig.2 Effect of enzyme load on polysaccharide yield

在确定酶解时间6h后，固定pH2，温度50℃条件下，对加酶量进行选择。结果见图2。

由图2可知，样品酶解时随着胃蛋白酶用量的增加，海参多糖的得率呈逐渐上升趋势，当胃蛋白酶用量(m/m)超过0.8%时，得率开始呈现下降的趋势，这可能是由于酶与底物之间的浓度达到饱和，再增加酶用量，酶解作用较小。因此，选择酶用量为0.8%。

2.4 pH值对胃蛋白酶酶解效果的影响

酶解时，pH值过低或过高都会影响胃蛋白酶的活性。在酶解时间6h、加酶量0.8%、温度50℃条件下酶解，考察不同pH值对多糖得率的影响，结果见图3。

图3 pH值对多糖得率的影响Fig.3 Effect of initial pH on polysaccharide yield

由图3可见，pH值由0.5增至1时多糖得率有所增加，当pH值达到1后，随着pH值的增加，多糖得率逐渐减少。这是因为胃蛋白酶是酸性蛋白酶，在酸性条件下活性最强，随着pH值的增加其活性会受到抑制，而盐酸用量过多会对多糖进行降解，因此，选择pH1进行酶解。

2.5 酶解温度对胃蛋白酶酶解效果的影响

每种蛋白酶都有各自的最适作用温度，温度过低或者过高都会影响其活性。在pH1、加酶量0.8%条件下酶解6h，考察不同酶解温度对多糖得率的影响，结果见图4。

图4 酶解温度对胃蛋白酶酶解效果的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on polysaccharide yield

由图4可知，在40～55℃酶解温度范围内，随着酶解温度的升高，海参多糖得率逐渐增加；酶解温度大于55℃时，再增加酶解温度，多糖得率呈现下降趋势。酶解温度对酶催化反应的影响是多方面的，包括对酶催化反应的速度和对酶稳定性的影响。温度升高时，酶催化反应的速度大大加快，而酶的稳定性随着酶解温度升高而变差，当这两种效应达到平衡时即为酶的最适温度，酶活力最大[14]。最适酶解温度为55℃。

2.6 采用响应面法优化胃蛋白酶酶解工艺条件

2.6.1 分析因素的选取及分析方案

根据Box-Benhnken模型的中心组合试验设计原理[15]，选取海参多糖提取的酶解时间(A)、酶解温度(B)、pH值(C)、酶用量(D)为自变量，多糖得率为响应值，试验因素及水平设计见表2。

表2 响应面法分析因素及水平Table2 Factors and levels in the response surface design

2.6.2 响应面分析与试验结果

表3 响应面分析方案及试验结果Table3 Response surface design layout and experimental results

取27个试验点，分为24个析因点和3个零点。其中析因点为自变量，取值在A、B、C、D所构成的三维顶点上；零点为区域的中心点，零点重复3次，以估计试验误差。试验设计及结果见表3。

2.6.3 模型的建立与显著性检验

采用Design 7.0软件对表3中的试验数据进行多元回归拟合，得回归方程：

R= 1.36－0.049a＋0.040b－0.17c＋0.16d－0.071ab＋0.19ac－0.006357ad－0.12bc＋0.055bd－0.18cd－0.21a2－0.23b2－0.12c2－0.29d2

式中：a=(A－6)/2，b=(B－55)/10，c=(C－2)/1，d=(D－0.8)/0.4；a、b、c、d为编码值，A、B、C、D为真实值，R为多糖得率/%。

对模型系数显著性检验结果见表4，模型的方差分析结果见表5。

表4 模型回归系数显著性检验和结果Table4 Significance test for regression coefficients of the established regression model

表5 模型检定结果的分析Table5 Results of statistical evaluation of the established regression model

由表4、5可知，试验模型对试验拟合良好，模型P=0.0178＜0.05，表明该试验模型显著。失拟项P= 0.0571＞0.05，说明方程对试验的拟合度较好，此方法可靠。表5表明各因素对多糖得率的影响不同，其中酶解pH值影响最大，酶用量次之，均达极显著水平；酶解温度、酶解时间对多糖得率无显著影响；酶用量与酶解温度的交互项达到显著水平。

2.6.4 响应面分析图

通过多元回归方程分析得知4个因素及其交互作用对多糖得率的影响情况。该影响可以用响应曲面和等高线来表示。图5～10分别表示酶解温度与酶解时间、酶解pH值与酶解时间、酶解加酶量与酶解时间、酶解pH值与酶解温度、酶解加酶量与酶解温度、酶解加酶量与酶解pH值，6组因素对海参多糖胃蛋白酶酶解效果的影响。

图5 多糖得率=f(A,B)的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis temperature and duration

图6 多糖得率=f(A,C)的响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis duration and initial pH

图7 多糖得率=f(A,D)的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis duration and enzyme load

图8 多糖得率=f(B,C)的响应面和等高图Fig.8 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis temperature and initial pH

图9 多糖得率=f(B,D)的响应面和等高图Fig.9 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of hydrolysis temperature and enzyme load

图10 多糖得率 =f(C、D)的响应面和等高图Fig.10 Response surface and contour plots of polysaccharide yield as a function of enzyme load and initial pH

RSM图形是指在其他因素水平固定的条件下，响应值与试验中两因素所构成的三维曲面图，可直观地反映各因素之间的相互作用对响应值的影响。图5～10直观的给出了各个因素交互作用响应面的3D图和等值线图。从响应面的最高点和等值线可以看出，在所选范围内存在极值。

2.6.5 最佳酶解条件

由Design软件的岭脊分析得到海参多糖的最佳酶解条件，即酶解时间5.42h，酶解温度56.19℃，酶解液pH1.12，胃蛋白酶用量0.95%。在此条件下海参多糖的得率为1.59%。为检验RSM法的可靠性，采用上述最佳酶解条件做验证实验。考虑到实际操作，将最佳酶解条件修正为酶解时间6h、酶解温度56℃、酶解液pH1、胃蛋白酶用量0.95%。在此条件下海参多糖得为1.65%。与理论预测值基本相符，说明该回归方程能较真实地反映各因素对海参多糖酶解效果的影响情况。

3 结 论

用胃蛋白酶提取海参多糖，获得具有较高多糖得率的酶解液，为海参酸性黏多糖的制备提供研究基础。利用响应面分析得出优化的酶解工艺条件为酶解时间6h、酶解温度56℃、酶解液pH1、胃蛋白酶用量0.95%，在此最优工艺条件下，多糖得率可达到1.65%，该值与响应面模型的预测值1.59%基本相符，说明响应面模型可优化酶解工艺条件。

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Optimization of Enzymatic Polysaccharide Extraction from Acaudina molpadioides Semper by Response Surface Methodology

XU Lu，YE Li-bin，YU Ping，LI Jian-rong*
(Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

Papain, pepsin and trypsin were chosen to conduct the single enzyme hydrolysis of Acaudina molpadioides Semper for polysaccharide extraction, and pepsin was the selected enzyme due to the highest polysaccharide yield. The hydrolysis of Acaudina molpadioides Semper with pepsin was optimized by response surface methodology in order to improve polysaccharide yield. The optimal conditions for pepsin hydrolysis were found to be: enzyme load, 0.95%; hydrolysis temperature, 56 ℃; initial pH, 1; and hydrolysis duration, 6 h. An experimental polysaccharide yield of 1.65% was obtained under these conditions, which basically accorded with the model predicted value of 1.59%.

Acaudina molpadioides Semper；polysaccharide；enzymoysis；response surface methodology

TQ929.2

A

1002-6630(2010)20-0061-06

2010-01-07

徐逯(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为功能因子。E-mail：xuluyaya12345@126.com

*通信作者：励建荣(1964—)，男，教授，博士，研究方向为农产品、水产品贮藏加工与安全控制。E-mail：lijianrong@zjgsu.edu.cn