酶解乳清浓缩蛋白WPC80制备乳清肽的研究

任国谱，余 兵

(中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

酶解乳清浓缩蛋白WPC80制备乳清肽的研究

任国谱，余 兵

(中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

用乳清浓缩蛋白WPC80为原料，在复合酶A的作用下，研究乳清肽的制备工艺。复合酶A的反应条件为[S]12g/100mL、温度50℃、[E]/[S]3%、pH9.0。选用截留分子质量10kD的磺化聚砜膜，常温并在工作压差0.25MPa下对水解液进行超滤处理后，选用树脂HZ00x对水解液进行脱苦，得到的处理液无明显的苦涩味，只有轻微的蛋腥味，最后肽得率36.54%。产品中肽的分子质量分布以二、三和四肽为主，分别占峰面积的27. 45%、34.88%和26.65%。

乳清肽；蛋白酶；乳清浓缩蛋白

乳清粉是干酪生产中的副产物，乳清浓缩蛋白WPC80是蛋白质含量为80%以上的乳清浓缩蛋白，具有较高的生物价和良好的功能特性。但乳清蛋白中的β-乳球蛋白和免疫球蛋白E(IgE)常常引起一些人群的过敏反应[1-5]，因此，部分水解乳清蛋白或深度水解乳清蛋白是防止过敏反应的有效方法之一。另外，酶解乳清蛋白产生的乳清肽具有多种生物活性功能，包括抗菌[6-7]、抗高血压[8-9]、镇静和增进新陈代谢的同化作用等[10-11]。

目前，通过酶解技术生产肽类物质的研究较多[9,12]，但对于应用于防止过敏的婴幼儿食品的乳清肽配料的研究较少。对后者的生产，除了要考虑肽的大小和肽的得率外，还需考虑风味控制和灰分含量等指标。本实验选用WPC80作为制备乳清肽的原料，研究其生产工艺过程及其工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

WPC80 戴维林国际工贸有限公司；粉末活性炭(80～120目) 北京大力精细化工厂；大孔吸附树脂(HZ801、HZ802、HZ803、HZ00x) 上海华震科技贸易公司。

碱性蛋白酶(活力20万U/g) 广西南宁庞博生物工程有限公司；木瓜蛋白酶(活力300U/g) BIB分装；复合酶A(由碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合而成，质量比为1:2) 自制；乙腈(色谱纯) 江苏淮阴精细化工研究所；其余试剂均为市售分析纯试剂。

8200型超滤杯 美国Millipore公司；超滤膜(磺化聚砜膜，型号分别为SPES20、SPES50、SPES100，对应的截留分子质量分别为2、5、10kD) 美国星达膜业有限公司；DYY-1C型电泳仪 北京市六一仪器厂；2695型高效液相色谱仪 美国Waters公司；Merck反相C18柱(用于肽谱的分析)、分离柱Shodex protein KW-803(用于肽的分子质量分布分析) 上海曦玉分析仪器科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质的分子量分布

采用SDS-PAGE法[13]测定。

1.2.2 肽高效液相色谱的分析条件

采用HPLC法[9]。检测波长220nm；进样量10μL；流速1.0mL/min。线性梯度洗脱：A液，V(乙腈):V(水): V(三氟乙酸)=5:95:0.1；B液，V(乙腈):V(水):V(三氟乙酸) =95:5:0.1。在50min内，B液从5%到70%。

1.2.3 肽的分子质量分布

采用HPLC法[9]。检测波长220nm；进样量10μL；流速0.5mL/min；流动相：V(乙腈):V(水):V(三氟乙酸) =10:90:0.1；回归方程：lgMW=3.8917－0.063t，R2=0.9935。

1.2.4 肽质量浓度的测定

采用双缩脲法[14]测定肽质量浓度。

1.2.5 灰分的测定[15]

将酶解后的WPC80干燥后，取干燥样进行灰分的测定，用g/100g(干基)表示。

1.2 6肽得率

1.2.7 酶解液风味的判定

异味等级分为5级，分别表示为无(0)、轻微(1)、较重(2)、重(3)和严重(4)。品尝小组成员7人，打分后求其平均值，然后与相应的异味等级相对应。

1.2.8 工艺流程

生产乳清肽的工艺流程：WPC80→加水还原(水温40～60℃)→酶解→灭酶→超滤→吸附脱苦→杀菌浓缩→喷雾干燥→成品

2 结果与分析

2.1 水解用酶的选择及酶解条件的确定

一个酶解反应的进行，主要涉及到底物的质量浓度、水解酶质量分数(以[E]/[S]的百分数表示)、pH值、水解温度T/℃和水解时间t/min等因素的影响。通过酶的筛选研究[12]，确定底物的质量浓度12g/100mL、温度50℃、时间60min，这样需要通过实验确定pH值和酶的质量分数[E]/[S]。

pH值的选择除了考虑酶的稳定性和底物的特殊性外，还要考虑酶解液的风味和灰分含量。复合酶A在pH7～12都有活性，WPC80在此pH值范围内都有较好的溶解度，用灰分含量为考核指标，在[S]12g/100mL、水解温度50℃、水解时间60min、[E]/[S]为3%的条件下，选取不同的pH值进行酶解反应，结果见图1。

图1 pH值对灰分的影响Fig.1 Effect of pH on ash content of hydrolyzed WPC 80

过高pH值不仅会影响产品的质量和风味，而且从图1可以看出，pH值增加，酶解物中的灰分也明显增加，因此，选p H值为9.0。

在pH9.0、[S]12g/100mL、水解温度50℃、水解时间60min条件下，选取不同的[E]/[S]进行酶解反应，结果见图2。

图2 [E]/[S]对肽得率的影响Fig.2 Effect of enzyme/substrate ratio on peptide yield

从图2可以看出，[E]/[S]超过3%时肽得率增长缓慢，而且超过7%时趋势线不再规则，可能有副反应发生，因此，选择[E]/[S]为3%。

2.2 风味曲线及水解程度的控制

图3 复合酶A水解WPC80的风味曲线Fig.3 Bitterness change during WPC 80 hydrolysis

图3是复合酶A在所选用的条件下水解WPC80得到的风味曲线。

图4 制备乳清肽的时间-肽得率图Fig.4 Time course of peptide yield during WPC 80 hydrolysis

在控制风味的前提下，应尽量提高水解度。结合肽得率和风味曲线综合考虑，生产乳清肽时，应选择风味较好的高水解度点，以确保肽的得率。从图4来看，酶解反应1h后肽得率增加缓慢，而且随着时间的增加苦味程度增加，直到3h后水解液苦味才减轻。因此，在所选用条件下水解1h，离心后得到的肽得率为47.24%，水解液苦味程度中等，是较为合适的。

2.3 酶解过程中蛋白质分子质量的变化(SDS-PAGE)

WPC80经酶解离心(4000r/min，10min)除去不溶物后，可溶解部分既有大分子质量的蛋白，也有较小相对分子质量的肽类和游离氨基酸，图5是复合酶A水解WPC80的过程中，用SDS-PAGE法测定分子质量，所得到的WPC80的分子质量变化图。随着反应时间的延长，水解反应趋于平缓，经150min后已经水解完全。

图5 酶解WPC80水解时间-分子质量动态变化Fig.5 SDS-PAGE analysis of WPC 80 hydrolysis process

2.4 酶解液的分离

为了得到乳清肽，需要除去分子质量大的成分，选用超滤技术来分离乳清肽。水解灭酶(90℃、10min)并离心(4000r/min、15min)后，在常温0.25MPa操作压力条件下，超滤结果见表1。

表1 不同截止分子质量(COMW)的超滤膜的超滤结果Table1 Peptide yields after ultrafiltration through different MWCO membranes

使用COMW 2kD的膜，肽的得率降低，COMW 5kD的膜比较适中，但考虑到肽的得率，选用COMW 10kD的膜。

2.5 吸附脱苦

超滤后的WPC80水解液呈浅黄色，酶解液具有明显的苦味和其他不良风味，为了改善外观和口味，则需要进行吸附脱苦处理。

表2 脱苦处理对产品回收率和风味的影响Table2 Effect of resin type used for debittering on peptide recovery and flavor

表2比较了几种吸附剂的脱苦效果及其对产品回收率的影响，吸附剂的脱苦操作条件是40℃，磁力搅拌1 h。

通过比较，用树脂HZ00x进行处理结果理想，其回收率为90.20%，肽得率为36.54%，处理液无明显苦涩味，只有轻微的蛋腥味。

2.6 肽的HPLC谱图

图6是酶解液超滤和吸附脱苦后，用HPLC法得到乳清肽的谱图。可见，经过一系列的分离后，得到的乳清肽的组成成分仍然很复杂。

图6 乳清肽的HPLC分析图谱Fig.6 HPLC profile of the product obtained after ultrafiltration and debittering

2.7 肽的分子质量分布

图7是HPLC法测得的最终产品的分子质量分布图。据回归方程计算，产品中的主要成分中，二、三和四肽的数量最多，相对百分比分别占峰面积的27.45%、34.88%和26.65%，其他为11.02%，是比较理想的分布模式。

图7 HPLC法测定肽的分子质量分布Fig.7 HPLC analysis of molecular weight distribution of the final product obtained

3 结 论

3.1 复合酶A水解WPC80，其反应条件为[S]12g/ 100mL、水解温度50℃、[E]/[S]3%、pH9.0，在此条件下水解1h，其水解液苦味程度中等，肽得率为47.24%。3.2选用截留分子质量为10kD的磺化聚砜膜，常温下在工作压差为0.25MPa下对水解液进行超滤处理，肽得率40.51%。

3.3 选用树脂HZ00x对水解液进行脱苦处理，处理液无明显的苦涩味，只有轻微的蛋腥味，肽得率36.54%。

3.4 HPLC法测得的最终产品的分子质量分布以二、三和四肽的数量最多，分别占峰面积的27.45%、34.88%和26.65%，其他为11.02%，是比较理想的分布模式。

[1]MORALES P, FERNANDEZ-GARCIA E, GAYA P, et al. Hydrolysis of caseins and formation of hydrophilic and hydrophobic peptides by wild Lactococcus lactis strains isolated from raw ewes milk cheese[J]. Journal of Applied Microbiology, 2001, 91: 907-915.

[2]TOMITA M, BELLAMY W, TAKASE M, et al. Potent antibacterial peptides generated by pepsin digestion of bovine lactoferrin[J]. J Dairy Sci, 1991, 74: 4137-4142.

[3]BENNETT L, WHEATCROFT R, SMITHERS G. A review of allergic and intolerant reactions to dairy protein experienced by non-infant consumers[J]. Australian Journal of Dairy Technology, 2001, 41(2): 126-129.

[4]ISABELLE N, SYLVIE G, SYLVIE L T. Interaction between bovine β-lactoglobulin and peptides under different physicochemical conditions [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50: 1587-1592.

[5]LEE Y S, NOGUCH T, NATIO H. Intestinal absorption of calcium in rats given diets containing casein or amino acid mixture: the role of casein phosphopeptides[J]. Br J Nutr, 1983, 49: 67-76.

[6]MEI H, FRISTER H. Chemical characterization of bioactive peptides from in vivo digests of casein[J]. J Dairy Res, 1989, 56: 343-349.

[7]TRUCHITA H, GOTO T, SHIMIZU T, et al. Dietary casein phosphopetides prevent bone loss in aged ovariectomized rats[J]. J Nutr Sci, 1996, 126(1): 86-93.

[8]MANNHEIM A, CHERYAN M. Continuous hydrolysis of milk protein in a membrane reactor[J]. J Food Sci, 1990, 55(2): 381-390.

[9]吴建平, 丁霄霖. 大豆降压肽的研制[D]. 无锡: 无锡轻工大学, 1998: 25-26.

[10]FOEGEDING E A, DAVIS J P, DOUCET D, et al. Advances in modifying and understanding whey protein functionality[J]. Trends in Food Science and Technology, 2002, 13(5): 151-159.

[11]LAJOIE N, GAUTHIER S F, POULIOT Y. Improved storage stability of model infant formula by whey peptides fractions[J]. J Agric Food Chem, 2001, 49(4): 1999-2007.

[12]任国谱, 李忠海, 彭灿, 等. 高蛋白低聚肽奶粉生产用酶的筛选研究[J]. 食品科学, 2009, 30(3): 197-200.

[13]陈曾夑, 刘兢, 罗丹. 生物化学实验[M]. 合肥: 中国科学技术大学出版社, 1994: 26-31.

[14]任国谱, 李忠海, 彭美纯, 等. 奶粉中低聚肽质量浓度测定方法[J].中国乳品工业, 2007, 35(10): 47-50.

[15]GB/T 5413.7—1997婴幼儿配方食品和乳粉中灰分的测定[S].

Enzymatic Preparation of Oligo-peptides from Whey Protein Concentrate 80

REN Guo-pu，YU Bing (College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

Whey protein concentrate (WPC) 80 was hydrolyzed with an enzyme complex consisting of alacase and papain (1: 2 mass ratio) to prepare oligo-peptides in the present study. The hydrolysis conditions for the preparation of oligo-peptides were as follows: substrate concentration, 12 g/100 mL; reaction temperature, 50 ℃; and pH 9.0. The hydrolysate was ultrafiltrated through a sulfonated polysulfone membrane having a molecular weight cut-off (MWCO) of 10 kD under the conditions of normal temperature and 0.25 MPa working pressure difference and debittered by HZ00x resin adsorption. The resultant product had a little bitter taste and a light egg odor. The peptide yield was 36.54% under the above process conditions. The molecular weight distribution of peptides in the final product was mainly dipeptides, tripeptides and tetrapeptides, representing 27.45%, 34.88% and 26.65% of the total peak area, respectively.

whey peptide；enzyme；whey protein concentrate

TS252.9

A

1002-6630(2010)20-0011-04

2010-01-05

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD04A15)

任国谱(1964—)，男，教授，博士，研究方向为功能性乳制品。E-mail：topren@vip.163.com