响应面分析法优化香菇中γ-谷氨酰转肽酶的超声辅助提取条件

励建荣，尹 洁，朱军莉，章 庆

(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江 杭州 310035)

响应面分析法优化香菇中γ-谷氨酰转肽酶的超声辅助提取条件

励建荣，尹 洁，朱军莉，章 庆

(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江 杭州 310035)

采用响应面分析法对香菇中γ-谷氨酰转肽酶的超声提取工艺进行优化。在单因素试验基础上，根据中心组合(Box-Benhnken)试验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法，以γ-谷氨酰转肽酶的提取率为响应值进行回归分析。结果表明超声辅助提取GGT的最佳条件为提取功率、提取时间、料液比的最佳条件分别为204.84W、28.19min、1:52.29。在上述提取条件下，提取液中GGT的提取率达到11.19U/g，与模型预测值基本相符。

香菇；γ-谷氨酰转肽酶；超声辅助提取；响应面法

很多生物体都会产生内源性甲醛，其中以香菇最为突出，2001年“香菇甲醛”事件使我国食用菌产业蒙受巨大损失。香菇中内源性甲醛的研究始于上世纪70年代，日本学者Yasumto[1-4]及Fujimoto等[5]首次对香菇甲醛的形成机理作了研究报道，他们将粗酶提取液作用于灭酶的香菇匀浆液，发现香菇甲醛是其特征风味物质酶学代谢途径的副产物，其中γ-谷氨酰转肽酶(γglutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)是该催化反应产生甲醛的关键酶[6]。目前对细菌、酵母中GGT的研究较多，对香菇中GGT的研究较少，对其提取效率的研究更少。对该酶的结构及其酶学性质研究有助于进一步明晰甲醛在香菇风味物质形成途径产生的机理，并且为开发香菇甲醛产生的抑制方法提供科学的参考依据。而香菇中蛋白质含量较低，要获得足够量且活力未严重损失的GGT粗酶液以供进一步研究，提取效率的提高十分关键。已知GGT是广泛存在于生物体内参与谷胱甘肽循环的酶，该酶主要存在于细胞膜的外表面上，通过亚基和细胞膜相连[7]，使常规静置提取法提取率较低。超声波技术用于蛋白质及酶的提取具有明显的优势，与静置提取法相比，超声波产生的强烈振动、空化效应、搅拌作用等可以加速提取成分的释放，提高提取率，有效缩短提取时间[8-10]。本实验采用超声辅助提取法改进香菇中GGT的提取工艺，为深入研究GGT及香菇内源性甲醛的形成机理提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜香菇采自浙江庆元，经真空冷冻干燥后粉碎，保存于－70℃；γ-谷氨酰-对硝基苯胺(γ-glutamyl-P-nitroanilide)、β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、对硝基苯胺(P-nitroanilide) 美国Sigma公司；其余试剂为国产AR级试剂。

1.2 仪器与设备

UV2550紫外可见分光光度计 日本岛津公司；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机 上海新芝生物技术研究所；DELTA320 pH计 美国Mettler Toledo公司。

1.3 香菇GGT的提取方法

准确称取1.00g香菇粉置于100mL三角烧瓶中，加入一定量0.5mol/L Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液，放置在冰浴环境中，用超声辅助提取法提取GGT，将该提取液8000 ×g离心20min后取上清液测酶活，计算得率。

1.4 酶活测定方法及提取率计算

GGT催化γ-glutamyl-P-nitroanilide的产物P-nitroanilide在410nm处有吸光度[11]，酶活性由生成产物的量反映。反应体系为0.5mol/L Tris-HCl(pH7.6)缓冲液4.0mL、酶液 0.5mL、3.5μmol/mL底物0.5mL，37℃反应20min，加入3mL 1.5mol/L乙酸终止反应，过滤后在410nm处测吸光度(A)。酶活单位(U)定义为在上述反应条件下，每分钟生成1μmol的P-nitroanilide为1个酶活单位。

GGT提取率/(U/g)=样品GGT活性/香菇粉质量

1.5 单因素试验和响应面试验

超声辅助提取法单因素试验分析不同料液比、提取时间、功率对GGT得率的影响。具体为称取1.00g香菇粉，分别加入0.5mol/L Tris-HCl(pH7.6)缓冲液25、50、75、100、150mL，在4℃提取功率200W条件下提取10min；相同处理条件下，在4℃提取功率200W条件下分别提取5、10、20、30、40min；相同处理条件下，提取功率分别在50、100、150、200、250W条件下提取10min。根据单因素试验，结合Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，采用响应面分析法优化GGT的超声辅助提取法料液比、提取时间和功率提取工艺。

2 结果与分析

2.1 超声辅助提取GGT的单因素试验

2.1.1 料液比对GGT提取率的影响

设计料液比分别为1:25、1:50、1:75、1:100和1:150，在提取功率200W条件下超声提取10min，以考察料液比对GGT含量的影响(图1)。由图1可知，随着料液比的提高，GGT提取率不断增加，当料液比达到1:50后，进一步增加溶液的量，溶液中GGT含量增加不明显。高料液比条件下，GGT总的溶出量增加，提取过程中液相浓度增加快，两相浓度差减少加快[12]。高料液比在一定程度上提高传质推动力，但从提取效果、原料用量等方面综合考虑，确定料液比1:50较适宜。

图1 料液比对GGT提取率的影响Fig.1 Effect of material/water ratio on GGT extraction

2.1.2 提取功率对GGT提取率的影响

图2 提取功率对GGT提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on GGT extraction

固定料液比1:50，提取功率分别为50、100、150、200、250W超声提取10min，考察提取功率对GGT提取率的影响(图2)。由图2可知，提取功率对GGT提取率具有显著的影响。功率越高，GGT提取率越高，两者呈线性正相关关系。提取功率越高，对香菇细胞的破坏作用越大，溶剂扩散也越快，越有利于GGT的浸出。当功率大于200W时，进一步增加提取功率，GGT提取率下降。这可能是因为过高的功率产生的瞬间高温会使GGT的活性降低，因此，选择200W为较佳的提取功率。

2.1.3 提取时间对GGT提取率的影响

固定料液比为1:50，在提取功率为200W条件下分别超声提取5、10、20、30、40min，以考察提取时间对GGT提取率的影响(图3)。由图3可知，提取时间对GGT提取率有着显著的影响，在30min时GGT提取率最大，而后随着提取时间的进一步延长，GGT提取率出现了明显的下降趋势。超声促进胞内的GGT释放并扩散到胞外的溶剂中，大部分存在于破碎细胞内的GGT在最初的30min内释放到提取溶剂中，因而GGT提取率在这段时间内发生了显著的增长。但是过长时间的超声作用可能导致部分GGT结构破坏，GGT活性也随之下降，据此初步确定30min为较适宜的提取时间[13]。

图3 提取时间对GGT提取率的影响Fig.3 Effect of extraction duration on GGT extraction

2.2 采用响应面法优化GGT的提取工艺

2.2.1 响应面分析的试验设计及结果

根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理[14-16]，利用Minitab15软件进行Box-Behnken试验设计，试验因素和水平设计见表1，试验方案及结果见表2。

表1 响应面分析法的因素与水平表Table1 Factors and levels in the response surface design

表2 响应面分析结果Table2 Response surface design matrix and experimental results

表3 回归方程的方差分析Table3 Variance analysis of the developed regression model

用Design-expert 7.0 对试验结果进行回归分析及方差分析，拟合得到回归方程为Y=10.43＋0.47A＋2.13B－0.025C+0.31AB－0.53AC－1.23BC－1.88A2－6.11B2－0.80C2

从表3可以看出，回归方程因变量和自变量之间的线性关系显著(R2=0.9187)，方程P= 0.0285＜0.05，说明此回归方程显著；失拟项P=0.0970＞0.05，说明方程对实验的拟合度较好，此实验方法可靠。

2.2.2 提取工艺的确定及验证实验

显著因素水平的优化运用Design-expert 7.0 软件对回归模型进行规范性分析，寻求最大提取率的稳定点及对应的因素水平，结合图4～6给出的回归方程的三维响应面图和等高线图可知，回归模型存在稳定点，稳定点即最大值。对回归方程求极值点得：A=0.0968，B=－0.1811，C=0.0914，Y=9.897，即提取功率、提取时间、料液比的最佳值分别为204.84W、28.19min、1:52.29，此时GGT提取率达到最大值为11.19U/g。在此条件下进行3次验证实验，GGT平均提取率为11.07U/g，与理论值基本相符，这说明回归方程能较真实地反映各因素对GGT提取率的影响。

图4 提取功率与提取时间对GGT提取率交互影响效应响应面图及等高线图Fig.4 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of ultrasonic power and extraction duration on GGT extraction

图5 提取功率与料液比对GGT提取率交互影响效应响应面图及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of ultrasonic power and material/water ratio on GGT extraction

图6 提取时间与料液比对GGT提取率交互影响效应响应面立体分析图及其等高线图Fig.6 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of extraction duration and material/water ratio on GGT extraction

3 结 论

本实验选取料液比、提取时间、提取功率3个因素进行响应面试验设计。采用Box-Behnken设计和Minitab15、Designexpert 7.0软件进行设计和分析，得到超声辅助提取GGT的最佳条件为：提取功率、提取时间、料液比的最佳条件分别为204.84W、28.19min、1:52.29。在最佳提取条件下，提取液中GGT的提取率达到11.19U/g，与理论值基本相符。这说明回归方程较真实地反映各因素对GGT提取率的影响。

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Optimization of Conditions for Ultrasonic-assisted Extraction of γ-Glutamyltranspeptidase from Shiitake Mushroom by Response Surface Methodology

LI Jian-rong，YIN Jie，ZHU Jun-li，ZHANG Qing
(Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

In order to optimize the ultrasonic-assisted extraction of γ-glutamyltranspeptidase (GGT) from shiitake mushroom, single factor investigations were initially carried out, followed by construction of a three-factor, three-level Box-Benhnken experimental design, quadratic regression fitting for GGT activity as a function of three extraction conditions and response surface analysis. The optimal conditions for the ultrasonic-assisted extraction of GGT were found to be: ultrasonic power, 204.84 W; extraction duration, 28.19 min; and material/water ratio, 1:52.29. Under the above conditions, the experimental value of GGT activity was 11.19 U/g, which was in basic agreement with the model predicted value.

shiitake mushroom；γ-glutamyltranspeptidase；ultrasonic-assisted extraction；response surface methodology

Q949.329.81；O658

A

1002-6630(2010)20-0020-04

2009-10-18

教育部科学技术研究重点项目(208054)；浙江省自然科学基金项目(R3090330)；国家质检总局科技计划项目(2009IK180)

励建荣(1964—)，男，教授，博士，研究方向为农产品、水产品贮藏加工与安全控制及食品生物技术。E-mail：lijianrong@zjgsu.edu.cn