乳腺癌中 TP、VEGF-D、VEGFR-3的表达及与淋巴管生成关系的研究

杨淑改 王福安 李惠翔 臧卫东

淋巴道转移是乳腺癌最常见的转移途径。胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)足近年来发现的细胞生长因子，TP通过血管生成作用促进癌细胞的生长和转移[1-3]。TP除促进血管生成作用外，也具有促淋巴管生成作用。血管内皮生长因子-D(vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D)与其受体血管内皮生长受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)相结合后促进肿瘤淋巴管生成和扩张，与淋巴结转移密切相关[4]。D2-40是目前敏感性和特异性均较高的淋巴管内皮特异性标记物[5]。本研究应用 SP免疫组化法检测乳腺癌和正常乳腺组织中 TP、VEGF-D、VEGFR-3表达及 D2-40标记的阳性淋巴管数，探讨其与乳腺癌临床生物学行、转移及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 标本及临床病理资料 收集郑州大学一附院 2004-2006年乳腺癌手术切除标本 37例和正常乳腺组织手术切除标本 30例，乳腺癌患者术前均无放疗、化疗及其他治疗史年龄 31～75岁，平均年龄(50±17)岁。经病理证实，37例乳腺癌组织均为浸润性导管癌，其中年龄 ＜50岁的 23例，年龄≥50岁的 14例；肿瘤直径 ＜20 mm的 10例，≥20 mm的 27例；有淋巴结转移 20例，无区域淋巴结转移 17例；组织学分级:Ⅰ级 7例，Ⅱ级 22例，Ⅲ级 8例。

1.2 主要试剂 TP鼠抗人单克隆抗体，购自 Roche公司(法国)；VEGF-D兔抗人多克隆抗体，购自武汉博士得公司；VEGFR-3即用型多克隆抗体、D2-40单克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；免疫组化SP检测试剂盒、DBA显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法 选取乳腺癌及正常乳腺组织存档腊块，连续 4μm切片，采用免疫组织化学SP法依试剂盒提供步骤操作，阳性对照切片由试剂公司提供，以 0.01 mol/LPBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 TP免疫组化信号位于细胞浆内，呈棕色或棕黄色颗粒，以免疫组化量化后数值:≤2者为阴性，＞2者为阳性。VEGF-D免疫组化阳性信号位于细胞浆内，呈棕色或棕黄色，以棕色或棕黄色颗粒的阳性细胞数≥10%为阳性，＜10%为阴性。VEGFR-3阳性表达主要位于间质细胞和肿瘤细胞胞浆内，为浅黄色至棕褐色颗粒，不着色至弱着色为阴性表达，中等着色至强着色为阳性表达。D2-40染色阳性标记的脉管数视为 LVD，参照 weidner[6]方法进行计数。

1.5 统计学分析 应用 SPSS 11.0统计软件，计量资料以 ¯x±s表示，采用 t检验，计数资料采用 χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TP、VEGF-D、VEGFR-3表达及淋巴管计数 37例乳腺癌组织中 TP、VEGF-D、VEGFR-3的阳性率和淋巴管计数明显高于 30例正常乳腺组织中的阳性率和淋巴管计数(P＜0.05)。见表 1。

表 1 乳腺癌组织和正常乳腺组织中 TP、VEGF-D、VEGFR-3表达及淋巴管计数 %

2.2 TP、VEGF-D、VEGFR-3表达及 LVD与乳腺癌临床病理特征及预后的关系 TP、VEGF-D、VEGFR-3阳性率及 LVD在淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组织(P＜0.05)，组织学分级越高，TP、VEGF-D、VEGFR-3表达 LVD增强(P＜0.05)。见表2。

表 2 乳腺癌中 TP、VEGF-D、VEGFR-3表达及 LVD与临床病理特征的关系

2.3 乳腺癌中 TP、VEGF-D、VEGFR-3表达与淋巴管计数关系

TP、VEGF-D、VEGFR-3阳性表达中 LVD明显高于 TP、VEGFD、VEGFR-3阴性表达(P＜0.01)。见表 3

表 3 乳腺癌中 TP、VEGF-D、VEGFR-3表达与淋巴管计数关系

3 讨论

乳腺癌是女性最常见，最多发的恶性肿瘤，严重危害其生命健康，乳腺癌容易发生淋巴结转移，淋巴管是肿瘤细胞扩散的主要途径[7]，肿瘤诱导淋巴管生成是淋巴道转移的重要步骤。肿瘤淋巴管生成造成淋巴管密度增加，使肿瘤细胞有更多的机会侵入毛细淋巴管，进入区域淋巴结，形成了淋巴道转移[8]。TP可逆性催化胸苷去磷酸化，诱导明显的血管新生。是否有淋巴管生成作用未见报道。本研究发现，乳腺癌 TP阳性表达率明显高于正常乳腺组织，无淋巴结转移组，组织学分级Ⅰ级病例 TP表达阳性率明显低于有淋巴结转移及Ⅱ或Ⅲ病例，说明TP表达与乳腺癌发生、进展及转移等生物学行为有密切关系。乳腺癌中 TP阳性表达淋巴管计数明显高于阴性病例。况明 TP具有促进肿瘤淋巴管生成作用。

VEGF-D为淋巴管生长因子，可与淋巴管内皮细胞上的VEGFR-3结合并使之激活，促进淋巴管内皮细胞的增殖和淋巴管的生成[9]。本研究中 VEGF-D、VEGFR-3在乳腺癌组织中表达高于正常乳腺组织，提示 VEGF-D、VEGFR-3在肿瘤发生发展中起作用:VEGF-D、VEGFR-3在淋巴结转移组及组织学分级Ⅲ级明显高于无淋巴结转移组及组织学分级Ⅰ级或Ⅱ级，表明VEGF-D、VEGFR-3与乳腺癌淋巴道转移有关，是乳腺癌预后的一项辅助判断指标:VEGF-D、VEGFR-3阳性表达中淋巴管计数显著高于阴性病例，表明 VEGF-D、VEGFR-3具有促进肿瘤淋巴管生成作用。

肿瘤胚胎性抗原 M2A是一种 40KD的唾液酸糖蛋白，D2-40最初是从胎儿的睾丸和生殖细胞肿瘤中分离出的 M2A抗原，能与淋巴管内皮反应，不与血管内皮反应，被认为是最具特异性的淋巴管标记物。本实验中 D2-40特异性地表达在淋巴管内皮细胞内，癌栓多见于癌周围扩张淋巴管。乳腺癌组织中LVD显著高于正常乳腺组织，提示乳腺癌中有大量淋巴管生成；LVD在淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组；组织学分级越高 LVD越大，提示淋巴管数量多少与淋巴结转移密切相关，是判断乳腺癌预后的重要指标。乳腺癌组织中TP、VEGFD、VEGFR-3的表达及淋巴管计数具有高度的一致性，表明三者在乳腺癌的淋巴管生成，淋巴结转移中起协同作用。

由此可见:TP、VEGF-D、VEGFR-3可促进乳腺癌淋巴管生成，是乳腺癌经淋巴道侵袭转移的重要因子，淋巴管数目的增多，使癌细胞更易于侵入淋巴管从而促进了淋巴结转移。乳腺癌中 TP、VEGF-D、VEGFR-3有助于判断乳腺癌的转移和预后。

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