食源性致病菌多重分子生物学检测技术研究进展

索 标 ,汪月霞 ,艾志录

( 1 .河南农业大学食品科学技术学院,河南郑州 450002 ; 2 .河南农业大学生命科学学院,河南郑州 450002 )

食源性致病菌多重分子生物学检测技术研究进展

索 标1,汪月霞2,艾志录1

( 1 .河南农业大学食品科学技术学院,河南郑州 450002 ; 2 .河南农业大学生命科学学院,河南郑州 450002 )

快速、可靠的食源性致病菌高通量检测方法对于确保食品安全具有重要意义,近年基于DNA水平的多重分子生物学检测技术迅速发展,针对各种不同的食源性致病菌建立了多种多重分子检测技术,包括多重PCR、多重实时荧光PCR以及基因芯片等。对这些多重分子检测技术的最新研究进展作一综述,并且建议在今后该技术的研究中,仍需要在食品中多种致病菌同时选择性增菌培养、亚致死损伤修复以及检测内标的构建等方面取得突破,从而能够更好地实现食源性致病菌的高通量检测。

多重分子方法;食源性致病菌;多重PCR;基因芯片;检测

食源性致病菌已经被公认是造成食品污染的重要原因之一,甚至可能会造成人类的死亡,常规的微生物学检测方法如平板菌落计数法和最大或然数法(MPN)等耗时耗力,需要5～7 d才能完成整个检测过程。食源性致病菌的快速检测和鉴定方法对食品企业内部安全卫生监控极为重要,政府部门也急需发展这些快速检测技术来用于履行食品安全监管职能。多重分子生物学检测方法由于在一个反应体系中同时完成多个检测目的[1],目前已经成功应用于食源性致病菌的安全检测,并建立了多重PCR、多重实时荧光PCR、基因芯片等多种检测技术。本文将对这些多重分子检测方法的研究进展作一综述,并针对这些方法在食源性致病菌安全检测应用中的关键技术问题和难点以及未来发展趋势提出意见。

1 食源性致病菌多重分子检测技术

1.1 多重PCR(M ultiplex PCR)

多重PCR技术是普通PCR技术的一种延伸,该技术在一个扩增体系中含有多对引物,可同时完成多个目的片段的扩增,达到多种检测的目的。现在该技术不仅用于多种致病菌的同时检出,如丁久法等[2]开发出的多重PCR方法用于大肠埃希菌O157和单核细胞增生李斯特菌同时检测,也有研究将该方法用于同一致病菌毒素分泌型[3]、血清型[4]或耐药[5]分型。影响多重PCR检测结果的关键因素之一是引物的设计,要求所有设计引物的退火温度必须非常接近,扩增产物大小的差别也要足够大以能够在琼脂糖凝胶电泳中有效区分开来。同时,多重PCR引物的各扩增之间也不能有干扰,否则会使得多重PCR的扩增反应体系难以得到优化,这在引物对数量较多的反应体系中尤为关键[6]。Rachlin等[7]开发出一种基于互联网的MuPlex软件,该软件根据相互作用参数、引物选择标准以及达到检测目标所需要的多重数,设计DNA序列的特异性引物,并为各靶点可能出现的竞争问题提供多种解决方案。此外,也有研究建议在多重PCR引物两端加上接头以解决各扩增之间的竞争问题[8]。Yuan等[9]开发出一种通用引物,由此设计的多重PCR检测方法,可完成食品中沙门氏菌、大肠埃希菌和单核细胞增生李斯特菌的特异性同时高效检出。

1.2 实时荧光PCR(Real-time PCR)

实时荧光PCR技术在核酸扩增过程中就能看到致病菌检测的结果,因此,与传统PCR方法相比,实时荧光PCR不需要后续的分析过程,从而显著缩短了检测的时间,也减少了实验室环境对扩增反应所带来污染的可能,该技术目前已经成为食源性致病菌检测技术开发的热点之一。此外,实时荧光PCR是一种定量检测方法,可以用来测定各种样品中致病菌的数目[10-11],因此在食品安全性风险评估中具有重要作用。用TaqMan探针进行的实时荧光PCR方法结合标记好的探针,根据荧光吸收波长的不同,可以在一个反应体系完成多个序列的扩增反应,同时检测多个不同食源性致病菌。目前,已经有一些研究报道用多重实时荧光PCR的方法实现食品中多种致病菌的同时检测。如利用多重实时荧光PCR方法完成沙门氏菌、大肠埃希菌O157和单核细胞增生李斯特菌的同时检测[12];多重实时荧光PCR的方法检测沙门氏菌中高致病性的血清型Choleraesuis以及Paratyphi C[13];多重实时荧光PCR方法同时检出不同血清型的沙门氏菌,包括Enteritidis、Gallinarum、Typhimurium、Kentucky以及Dublin等[14]。Guion等[15]利用PCR扩增产物的解链温度(Tm值)不同设计的多重实时荧光PCR检测方法,根据各种重要毒力因子对致泻性大肠埃希菌进行分型,可以在不需要昂贵的荧光探针的情况下完成多重检测,节约了检测的成本。然而,由于多重实时荧光PCR容易受到荧光检测器数量的限制[16-18],当待测样品中可能污染有大量多种致病性细菌时,很难用该方法完成高通量同时检测。

1.3 基因芯片检测技术(Microarray)

生物芯片技术是通过缩微技术,根据分子间特异性地相互作用的原理,将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统,以实现细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。1个基因芯片上可以含有成千上万个探针,一次检测可以同时检出多种致病菌。因此,基因芯片技术大大提高了检测工作的效率,为食源性致病微生物的高通量检测提供了非常有用的工具[19]。近年来,单核苷酸微阵列已被成功应用到多种致病性细菌以及病毒的检测与基因分型中,如Cremonesi等[20]建立的基于16S rDNA基因的可用于奶制品中15种致病性细菌检测的基因芯片检测方法,Wang等[21]开发出可用于13个食源性致病菌同时检测的基因芯片技术,该技术的检测灵敏度为102cfu。Suo等[22]与多重PCR扩增相结合,开发出可用于食品中大肠埃希菌O157∶H7、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌以及单核细胞增生李斯特菌同时检出的低密度芯片制作及检测方法,在这些致病菌的高通量检测中具有广泛的应用前景。

目前,基因芯片技术在致病菌的检测、诊断领域尚未得到广泛应用,其中一个重要的原因在于该技术目前尚无可信的标准,不同的实验室或试验平台得到的结果可能会各不相同,因此检测的准确性、重复性也没有保障[23-24]。为此,美国食品药品监督管理局(FDA)专门启动了基因芯片质量控制计划(Micro Array Quality Control, MAQC)[25-26],对政府部门、学术界以及工业界各自建立的1300多个基因芯片技术体系及其标准进行比较、验证。MAQC计划的研究结果表明,影响芯片结果的关键因素在于生物样品间的差别以及人为的因素,而并非该技术本身容易造成试验结果的多样性[27],这也表明不同试验平台所得到的基因芯片结果在理论上应该可以达到高度的一致性。该研究结果就为基因芯片技术在医学诊断、病原性致病菌检测领域的广泛应用提供了理论上的可能。然而,该技术真正广泛应用到实际操作中仍需要标准的、可靠的试验仪器以及方法等[28-29],如在基因芯片检测过程中,尚缺乏有效、简便的方法以获得足够量的荧光标记DNA与芯片上的探针进行杂交,并获得明显的特异性阳性结果。此外,开发如此高通量的检测方法,适宜的特异性分子检测靶点也是一个亟需解决的制约因素。

2 食源性致病菌多重分子检测方法的发展趋势和难点

2.1 食品中多种致病菌的同时选择性增菌是多重检测技术的瓶颈

为了能够真正在一个检测平台中完成多种食源性致病菌的同时检测,必须有一种培养液能同时增菌培养多种目的致病菌。目前常用的多种致病菌非选择性增菌液有缓冲蛋白胨水(buffered peptone water;Z3;Y3,BPW)、胰蛋白胨大豆肉汤(trypticase soy broth,TSB)以及营养肉汤(nutrient broth,NB)等,现已开发出一种通用预增菌培养液(universal preenrichment broth,UPB)可以用于多种食源性致病菌的同时增菌培养[30],该培养液可以从Difco Lab、Sparks、MD公司购买,并被许多检测方法所采用[31-32]。Kawasaki等[33]开发出一种No.17增菌液,可以用于食品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌以及大肠埃希菌O157∶H7的同时非选择性增菌培养,现在也已经应用于多重检测平台的开发[34]。然而,该类培养液中由于缺乏细菌生长抑制成分,不能选择性地增菌培养检测目的致病菌,因而不适用于背景菌群含量较高的食品样品,如食品原料或未经加工的动植物食品样品等。SEL培养液是新开发出来的应用于食品样品中沙门氏菌、大肠埃希菌O157∶H7以及单核细胞增生李斯特菌3种致病菌同时选择性增菌的培养基[35],该培养基中含有相应的细菌生长抑制物质,能有效的抑制食品中除这3种目的致病菌以外的其他背景菌群的生长,获得尽可能多的目的致病菌,在这3种致病菌的多重检测中具有广阔的应用前景。

2.2 现代多重分子检测方法不能忽视食品样品中亚致死损伤细胞的存在

食品中致病菌存在的高度危害性需要有效的控制技术对其进行杀灭,然而,目前常用的加热、高压等食品安全控制技术处理后的致病性细菌常处于3种不同的状态[36]:①未受到损伤的细胞,能够在选择性培养基和非选择性培养基上正常生长;②受到损伤、但仍具有修复能力的细胞,该类损伤细胞不能在加有选择性成分的培养基上生长,但能够在非选择性培养基上进行自我修复并增殖;③死亡细胞,该类细胞完全不具有活性,在选择性培养基和非选择性培养基上均不能生长。

食品样品中亚致死损伤细胞的存在一方面可能高估活性细胞存在的数目[37],也有可能低估活性细胞存在的数目[38],特别是在当检测前应用选择性培养基对食品样品进行预增菌培养时。只有重视食品中亚致死损伤细胞的存在,在基于DNA的分子生物学检测之前,采用合适的方法对致病菌损伤关键部位进行修复,才能真正实现食源性致病菌的安全检测。然而,目前在多重检测过程中所采用的损伤细胞修复方法,大多采用不含选择性成分的营养培养基,如UPB、TSB等[31,39],无法满足目标检测致病菌选择性增菌的需要。因此,选择合适的多重选择性增菌培养液是食源性致病菌多重检测的关键步骤之一。

2.3 可靠的分子生物学检测结果需要有效的内标作为假性结果的指示物

扩增内标是加入到PCR反应体系中的非靶点特异性DNA序列,可以与目标DNA一起扩增,用以将PCR检测过程中的可能出现的假阴性结果与真实的阴性结果区别开来。当用分子生物学的方法检测食品或环境中的致病性细菌时,由于食品基质、DNA提取过程中残留的有机酸以及其他多种因素均可抑制PCR扩增反应,影响分子生物学检测的结果,因此,扩增内标现在已经被认为是分子生物学检测技术所必须具有的[40]。用于PCR扩增的内标通常为加入反应体系的一段外源DNA序列,如果扩增内标所用的引物与检测所用的引物相同,称为竞争性扩增内标,如果2种引物不同,则为非竞争性扩增内标[41]。在传统PCR反应中,扩增内标与检测目标通过产物的大小相区分;在实时荧光PCR反应体系中,两者通过探针信号的不同吸收波长相区分;在基因芯片检测体系中,则一般用芯片上单独的样点和杂交结果来指示检测结果的可靠性[42]。

目前已经开发出多种构建扩增内标的方法,包括双链DNA、单链DNA、质粒、携带外源质粒的别种菌株、来源于其他菌株的基因组DNA等。Long等[11]首次采用DNA随机排序的方法设计出一段独特的I AC序列,该序列与检测目标DNA序列具有相同的长度和GC含量,采用基因工程的手段将该I AC序列导入单核细胞增生李斯特菌中构建突变菌株后,将该突变菌株加入荧光定量PCR反应体系中,由此构建了一个新型的食品中单核细胞增生李斯特菌的检测方法,该方法不仅可以用来指示检测过程中可能出现的假阴性结果,也可以用于食品样品中致病菌数目的定量检测。

3 结 论

现在已经建立多种基于DNA水平的食源性致病菌多重分子检测技术,由于这些技术所具有的高通量、快速、灵敏、高效以及特异性强的优点,在食源性致病菌的快速检测中具有广泛的应用前景。然而,未来该技术的研究仍需要在食品中多种致病菌同时选择性增菌培养、亚致死损伤修复以及检测内标等方面取得突破,以使得该类技术能够更好地为食源性致病菌高通量检测服务。

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Research Development on Multiplex Molecular Detection Methods of Foodborne Pathogens

SUO Biao1,WANG Yue-xia2,AI Zhi-lu1
(1.Coll.of Food Sci.&Technol.,2.Coll.of Life Sci.,Henan Agric.Uni.,Zhengzhou,450002)

Abstract:Rapid,dependable and high throughput methods to detect and characterize food borne pathogens is of great significance for food safety.Recently multiplex molecular methods based on molecular biology atDNA level have been developed rapidly,and established various multiplex molecular testing techniques including multiplex PCR, multiplex real-ti me fluorescence PCR and gene chip etc.The newest research progress was reviewed in this article, suggested that a breakthrough on the aspects of simultaneous selective enrichment,recovery of sublethal injured cells and construction of internal control in foods are still needed accordingly to serve for a better realization of high throughput detection of food borne pathogens.

multiplex molecular methods;food borne pathogens;multiplex PCR;gene chip;detection

Q93-33;R15

A

1005-7021(2010)06-0071-05

河南省重点科技攻关计划项目(082102320006)

索标 男,讲师。研究方向为食品微生物分子生态与食品质量安全。Tel:0371-63558150,E-mail:suobiao@gmail.com

2010-11-13;

2010-11-21