病毒利用泛素系统生存、增殖的方式

熊瑶,刘红霞,黄巧冰

1. 南方医科大学第一临床医学院,广州510515; 2. 南方医科大学基础医学院,广州510515

泛素是由76个氨基酸组成的小分子蛋白,在进化上高度保守。真核生物中,泛素系统是个复杂的体系,主要包括泛素,26S蛋白酶体和酶系统E1、E2、E3等。共价连接到底物蛋白的泛素能作为信号蛋白被蛋白酶体识别并降解;而泛素-蛋白酶体途径是细胞内非溶酶体蛋白降解的主要系统,在许多细胞功能,如抗原呈递、细胞周期调控、细胞凋亡、信号转导、转录控制和DNA修复中起重要作用。泛素化即泛素共价连接到底物蛋白。泛素化过程包括3个连续的酶促反应:①泛素被泛素活化酶(E1)以依赖于ATP的方式活化,其C端甘氨酸残基与E1活化的半胱氨酸残基之间形成一硫羟酸酯键;②活化的泛素通过另一个硫羟酸酯键被转移到泛素结合酶(E2)上;③泛素连接酶(E3)通过在泛素与底物蛋白赖氨酸残基间形成共价键把泛素转移到目标蛋白上。其中底物的特异性认为是由E3决定的,这是由于人类仅有1个E1；E2种类较多,且每个E2与1个或数个E3作用；而新发现的E3数量迅速增加,且E3仅靶向1个或数个底物。经过几轮的泛素化,多个泛素分子被连接到底物。一旦有达到4个以上泛素的多泛素链形成,底物很快被识别和降解。然而泛素化并不必然引起降解,在某些情况下泛素化可改变蛋白的生物活性或亚细胞定位,如蛋白的单泛素化也可作为内化、转录调控的信号,因而泛素化在细胞中也有重要的调控作用。26S蛋白酶体是存在于几乎所有真核细胞胞质和核中的多接触反应大蛋白酶,由1个20S的中央接触反应核心和2个位于两端的19S调节复合物组成。研究发现,许多病毒利用泛素系统为其自身服务,这涉及病毒生活史的各个阶段并干扰宿主抗病毒反应的多种方式;且多数情况下病毒在泛素连接酶的水平上调节泛素-蛋白酶体的功能:编码有E3功能的结构域或将宿主的E3导向新的底物[1]。现就病毒利用泛素生存、增殖的方式作一综述。

1 下调细胞表面免疫分子

尽管宿主有复杂的免疫系统来清除感染细胞,但病毒仍可潜伏和引起隐性感染。下调细胞表面免疫分子来减少抗原呈递已成为病毒逃避免疫监视的常见手段,其中泛素系统被有效利用以达到这一目的。

主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子为抗原呈递的重要分子,病毒能通过不同的方式利用泛素系统抑制其呈递过程。如人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)编码US2和US11糖蛋白,可促使新生成的MHCⅠ类分子重链从内质网移位到胞质,在胞质中被蛋白酶体降解。研究显示,这一依赖于US2和US11的移位是需要活性泛素系统的[2]。卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒蛋白K3为泛素连接酶,可促使MHCⅠ类分子形成多泛素链,进而作为信号致使MHC Ⅰ类分子内在化而被溶酶体降解,细胞内的Ubc13和UbcH5作为潜在的E2酶参与其中[3]。而EB病毒核抗原1(Epstein-Barr virus nuclear antigen-1, EBNA1)包含的Gly-Ala重复序列可阻止蛋白酶体对病毒蛋白的处理,抑制抗原肽呈递的早期步骤,从而干扰MHCⅠ类的免疫应答[4]。

同样,MHC Ⅱ类抗原的呈递也受泛素系统介导的抑制。如HCMV编码的糖蛋白US2在体外实验中可抑制外源蛋白抗原呈递给CD4+T细胞。US2导致源自内质网的Ⅱ类蛋白HLA-DR-α和HLA-DM-α快速向胞质移位,然后由泛素-蛋白酶体途径介导降解,以致很少Ⅱ类蛋白被呈递[5]。

此外,其他细胞表面免疫分子也可被病毒通过泛素系统下调。KSHV编码的蛋白K5与K3一样,是一种泛素E3连接酶,它能靶向除MHC Ⅰ类分子以外的多个免疫受体,使之降解,包括MHCⅠ类链相关基因A/B(MHC class Ⅰ chain-related molecules A/B,MIC-A/B)、CD86、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)等[3]。MIC-A/B是天然杀伤(natural killer,NK)细胞活化受体的配基,K5通过MIC-A/B的胞质末端赖氨酸残基泛素化导致MIC-A/B从细胞膜移位至细胞内,从而下调MIC-A/B的细胞表面表达[6]。由此可见,K3和K5充当E3连接酶不仅可帮助病毒逃避T细胞识别,还可避免进一步被NK细胞识别。有研究表明,T细胞的协同受体CD4可被黏液瘤病毒的M153R蛋白以类似于K5的方式下调。M153R作为泛素连接酶,将泛素连接到底物蛋白的胞质侧结构域,成为溶酶体的靶向信号,其后CD4在溶酶体中降解。M153R是在痘病毒和γ-2疱疹病毒中新发现的病毒蛋白家族,该家族还包括KSHV的K3和K5。其特点是有1个环指(ring finger)样结构域——PHD/LAP结构域(也称RING-CH结构域),起泛素连接酶的作用[7-9]。CD83对树突细胞活化有重要意义。研究显示,被单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染后,细胞表面CD83表达水平迅速下调,而有E3泛素连接酶功能的病毒即刻早期蛋白ICP0在其中扮演重要角色。转染表达CD83和有环指E3泛素连接酶功能缺陷的变异ICP0质粒不能降低CD83表达。抑制蛋白酶体的实验提示,蛋白酶体介导的降解在这一下调过程中也起重要作用[10]。

2 抑制细胞凋亡

当病毒入侵时,宿主细胞常启动凋亡程序作为一种防御机制来抑制病毒增殖,然而病毒反过来能抑制细胞凋亡,其中泛素系统也是其可利用的有效工具。如它可使肿瘤抑制蛋白、前凋亡蛋白等细胞与凋亡相关的因子泛素化,从而抑制凋亡。

肿瘤抑制蛋白P53是一种重要的转录因子,通过调控引起凋亡的程序在细胞生长调控中起关键作用。许多病毒正是通过下调P53来抑制凋亡。如人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)E6蛋白与细胞泛素连接酶E6相关蛋白作用形成复合物,使P53多泛素化及溶酶体降解[11]。KSHV编码的vIRF4可与泛素连接酶MDM2作用,抑制MDM2的自泛素化而使其稳定,从而增强P53的泛素化和蛋白酶体降解[12]。

黄杉毒蛾杆状病毒凋亡抑制蛋白Op-IAP3能阻止被感染的昆虫细胞凋亡。有研究显示,Op-IAP3与果蝇前凋亡蛋白HID的共表达可导致HID的泛素化。体外实验中,重组Op-IAP3蛋白也能促进自身和HID蛋白的泛素化,且HID的泛素化需要Op-IAP3的RING和BIR2的结构域参与[13]。推测Op-IAP3是一个功能性的E3泛素连接酶,其泛素化细胞前凋亡蛋白可能在抗凋亡中有重要作用。

3 调控病毒转录

泛素系统与病毒转录调控的关系也逐渐被人们发现和揭示,如蛋白酶体或泛素连接酶能正向调节某些病毒蛋白的转录活性。HPV E2蛋白对HPV基因表达调控是病毒生活周期的一个关键特征。Gammoh等研究显示,E2的最佳转录激活子功能需要活性蛋白酶体参与,其中涉及它与泛素连接酶MDM2的相互作用。MDM2的泛素连接酶活性已被证实在提高E2功能上起作用,且当E2与DNA识别序列结合时MDM2与E2能形成复合物。至于MDM2如何影响E2转录活性的具体机制仍不清楚,但Gammoh等推测它可能导致某些转录因子降解,从而增加转录允许和持续合成能力[14]。

然而,也有证据显示有些泛素化过程可能直接调控转录活性而不需通过蛋白酶体降解。人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)反式激活因子Tat蛋白可激活HIV-1的长末端重复序列。研究发现,癌蛋白HDM2与Tat相互作用并介导其泛素化,且能正向调节其介导的转录,提示Tat的转录活性是被泛素激活的;而将泛素连接到Tat上,则不需HDM2即可使其具备转录活性,支持了泛素正向调节Tat转录活性不需水解的观点,推测泛素化能招募影响转录的泛素结合蛋白。由于能结合泛素化蛋白的蛋白酶体19S调节复合物对RNA聚合酶Ⅱ的转录延伸有重要意义,且19S复合物在转录方面的作用在于其可作为一个不带水解功能的、能依赖ATP展开蛋白的伴侣素,因此Tat的泛素化可能将19S复合物引向HIV-1启动子[15]。

4 促使病毒出芽

新生病毒颗粒通过出芽方式离开宿主细胞,进而感染新细胞。泛素连接酶和泛素在病毒出芽中扮演重要角色,但机制不详。人们主要利用反转录病毒进行研究,并有许多证据提示泛素系统的可能作用。如反转录病毒颗粒中自由泛素丰富,反转录病毒结构蛋白Gag的可变片段可被单或多泛素化,蛋白酶体抑制剂阻碍了编码PT/SAP或PPXY结构域反转录病毒的出芽,很可能是因为缺少泛素;已知的泛素连接酶结合部位能引起病毒和病毒样颗粒释放,病毒PPXY基序可结合特殊的HECT泛素连接酶WW结构域,且有接触反应活性的泛素连接酶对编码PPXY基序病毒的有效出芽是必要的[16]。

一些病毒编码晚期(L)结构域,能利用与空泡蛋白分选(vacuolar protein sorting,VPS)相关的宿主蛋白促使病毒出芽。如HIV-1通过其Gag蛋白的L结构域结合2个E类VPS因子——TSG101和ALIX,离开受感染细胞。Chung等的研究显示,缺少与TSG101和ALIX结合的L结构域的HIV-1子代释放,可被HECT泛素连接酶NEDD4L/NEDD4-2的过表达而激活,且去除内源的NEDD4L能抑制这些缺陷病毒出芽。病毒出芽的激活依赖于NEDD4L的泛素蛋白酶体活性,且仅需最少量的HIV-1 Gag集合区,证明Gag有位于p6区之外泛素依赖的顺式反应L结构域活性。NEDD4L的激活也需要TSG101,并导致包括TSG101在内的多个ESCRT-1亚单位的泛素化。Mason-Pfizer猴病毒主要通过利用PPXY的L结构域招募NEDD4样蛋白协助出芽,其有效出芽同样也需要TSG101/ESCRT-1。这些现象提示,NEDD4L和其他NEDD4样蛋白可能以泛素化及活化ESCRT-1为病毒出芽服务[17]。

尽管依赖于PPXY基序的病毒出芽均需泛素和泛素连接酶及E类VPS因子参与,但两者间的相互作用关系并不清楚。由于泛素化可作为信号招募E类因子,一个通行的观点是将泛素置于病毒结构蛋白上可介导E类因子的招募。但最近Zhadina等研究显示,在依赖于泛素的出芽过程中泛素所连接的是其他因子而不是病毒蛋白[16]。

除上述4种方式外,病毒还可利用泛素系统影响干扰素信号途径以及自身复制、变异等达到生存、增殖的目的。此外,机体也利用泛素系统抵抗病毒感染。最近发现,泛素连接酶Nrdp1能通过活化激酶TBK1和转录因子IRF3,增加Toll样受体激动的巨噬细胞产生β干扰素,且Nrdp1能直接结合TBK1并使其多泛素化,从而激活TBK1。因此Nrdp1很可能作为泛素连接酶调控Toll样受体的应答来清除病毒[18]。TRIM是近年来受到重视的一个蛋白家族,研究显示它的许多成员可被干扰素诱导并能利用泛素连接酶活性发挥抗病毒作用。如TRIM5α可阻断反转录病毒感染,推测其能与病毒衣壳相互作用并自我泛素化,TRIM5α-病毒复合物被蛋白酶体降解,导致病毒感染的早期阻断[19];TRIM22被证实能以依赖其泛素连接酶活性的方式保护细胞免受脑心肌炎病毒感染,推测它可使脑心肌炎病毒编码的重要蛋白3CPRO泛素化,从而改变其蛋白酶活性或亚细胞定位[20]。

由此可见,病毒与泛素系统间的相互作用复杂,后者对病毒感染有多方面的影响。深入了解病毒利用泛素系统的机制,有助于为研究病毒感染机制提供新的视角,并为药物研发提供新的靶标。

[1] Gao G, Luo H. The ubiquitin-proteasome pathway in viral infections [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2006, 84(1): 5-14.

[2] Hassink GC, Barel MT, Van Voorden SB, Kikkert M, Wiertz EJ. Ubiquitination of MHC class I heavy chains is essential for dislocation by human cytomegalovirus-encoded US2 but not US11 [J]. J Biol Chem, 2006, 281(40): 30063-30071.

[3] Nathan JA, Lehner PJ. The trafficking and regulation of membrane receptors by the RING-CH ubiquitin E3 ligases[J]. Exp Cell Res, 2009, 315(9): 1593-1600.

[4] Zhang M, Coffino P. Repeat sequence of Epstein-Barr virus-encoded nuclear antigen 1 protein interrupts proteasome substrate processing [J]. J Biol Chem, 2004, 279(10): 8635-8641.

[5] Hegde NR, Tomazin RA, Wisner TW, Dunn C, Boname JM, Lewinsohn DM, Johnson DC. Inhibition of HLA-DR assembly, transport, and loading by human cytomegalovirus glycoprotein US3: a novel mechanism for evading major histocompatibility complex class Ⅱ antigen presentation [J]. J Virol, 2002(21), 76: 10929-10941.

[6] Thomas M, Wills M, Lehner PJ. Natural killer cell evasion by an E3 ubiquitin ligase from Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus [J]. Biochem Soc Trans, 2008, 36(Pt 3): 459-463.

[7] Mansouri M, Bartee E, Gouveia K, Hovey Nerenberg BT, Barrett J, Thomas L, Thomas G, McFadden G, Früh K. The PHD/LAP-domain protein M153R of myxomavirus is a ubiquitin ligase that induces the rapid internalization and lysosomal destruction of CD4 [J]. J Virol, 2003, 77(2): 1427-1440.

[8] Boname JM, Stevenson PG. MHC class I ubiquitination by a viral PHD/LAP finger protein [J]. Immunity, 2001, 15(4): 627-636.

[9] Coscoy L, Sanchez DJ, Ganem D. A novel class of herpesvirus-encoded membrane-bound E3 ubiquitin ligases regulates endocytosis of proteins involved in immune recognition [J]. J Cell Biol, 2001, 155(7): 1265-1273.

[10] Kummer M, Turza NM, Muhl-Zurbes P, Lechmann M, Boutell C, Coffin RS, Everett RD, Steinkasserer A, Prechtel AT. Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome [J]. J Virol, 2007, 81(12):6326-6338.

[11] Beaudenon S, Huibreqtse JM. HPV E6, E6AP and cervical cancer [J]. BMC Biochem, 2008, 9(Suppl 1): S4.

[12] Lee HR, Toth Z, Shin YC, Lee JS, Chang H, Gu W, Oh TK, Kim MH, Jung JU. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus viral interferon regulatory factor 4 targets MDM2 to deregulate the p53 tumor suppressor pathway [J]. J Virol, 2009, 83(13): 6739-6747.

[13] Green MC, Monser KP, Clem RJ. Ubiquitin protein ligase activity of the anti-apoptotic baculovirus protein Op-IAP3 [J]. Virus Res, 2004, 105(1): 89-96.

[14] Gammoh N, Gardiol D, Massimi P, Banks L. The Mdm2 ubiquitin ligase enhances transcriptional activity of human papillomavirus E2 [J]. J Virol, 2009, 83(3): 1538-1543.

[15] Brès V, Kiernan RE, Linares LK, Chable-Bessia C, Plechakova O, Tréand C, Emiliani S, Peloponese JM, Jeang KT, Coux O, Scheffner M, Benkirane M. A non-proteolytic role for ubiquitin in Tat-mediated transactivation of the HIV-1 promoter [J]. Nat Cell Biol, 2003, 5(8): 754-761.

[16] Zhadina M, McClure MO, Johnson MC, Bieniasz PD. Ubiquitin-dependent virus particle budding without viral protein ubiquitination [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(50): 20031-200366.

[17] Chung HY, Morita E, von Schwedler U, Müller B, Krüusslich HG, Sundquist WI. NEDD4L overexpression rescues the release and infectivity of human immunodeficiency virus type 1 constructs lacking PTAP and YPXL late domains [J]. J Virol, 2008, 82(10): 4884-4897.

[18] Wang C, Chen T, Zhang J, Yang M, Li N, Xu X, Cao X. The E3 ubiquitin ligase Nrdp1 ‘preferentially’ promotes TLR-mediated production of type I interferon [J]. Nat Immunol, 2009, 10(7): 744-752.

[19] Towers GJ. The control of viral infection by tripartite motif proteins and cyclophilin A [J]. Retrovirology, 2007,4: 40.

[20] Eldin P, Papon L, Oteiza A, Brocchi E, Lawson TG, Mechti N. TRIM22 E3 ubiquitin ligase activity is required to mediate antiviral activity against encephalomyocarditis virus [J].J Gen Virol, 2009, 90(Pt 3): 536-545.