抗病毒固有免疫分子TRIM22 C端SPRY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响

高波,段志坚,徐薇,熊思东

复旦大学免疫生物研究所,复旦大学上海医学院免疫学系,上海200032

三结构域(tripartite motif,TRIM)蛋白家族均含有1个RING(really interesting new gene)结构域、1或2个B-box结构域和1个卷曲螺旋结构域(coiled-coil)。60%的TRIM蛋白在C端还有SPRY结构域[1]。TRIM家族蛋白与机体的多种生理功能有关,如细胞增殖、分化、发育、凋亡等[1,2]。尤为值得关注的是,近年研究发现多种TRIM家族蛋白在抗病毒免疫中起重要作用[3-7],提示TRIM家族蛋白是一类广泛存在的、新型的抗病毒固有免疫分子[8,9]。TRIM22是干扰素诱导蛋白,多项研究表明它可有效抑制人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)的复制,是干扰素抑制HIV-1复制的关键效应分子[5,10,11]。另外,在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)及丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染猩猩的肝基因组学研究中发现,TRIM22与HBV及HCV的清除均有关[12],说明TRIM22亦可能在肝脏的抗病毒免疫中发挥作用。TRIM22的C端含有SPRY结构域。新近研究发现SPRY结构域在TRIM22的分子进化过程中起重要作用,并很可能与TRIM22对病毒的识别有关[13]。为研究SPRY结构域在TRIM22抗病毒免疫中的作用,本研究构建TRIM22的SPRY结构域缺失突变体,并对该突变体的功能进行初步研究。结果发现,SPRY结构域缺失突变体在转录及翻译水平上与野生型并无差异,但它完全丧失了核定位能力。

1 材料和方法

1.1 细胞系

人高分化的肝癌细胞系HepG2细胞株为本研究室保存。

1.2 试剂

真核表达质粒pcDNA3.1、TRIzol试剂购自Invitrogen公司。两步法反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒为Fermentas公司产品。DNA聚合酶LaTaq、T4 DNA连接酶和限制性内切酶NheⅠ、HindⅢ均为TaKaRa公司产品。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。胶回收试剂盒购自上海华舜公司。质粒提取使用Qiagen公司的质粒中量抽提试剂盒。鼠抗c-myc抗体(克隆号9E10)、鼠抗人GAPDH抗体及FITC标记的羊抗鼠IgG二抗均购自Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记羊抗鼠IgG抗体购自上海康成生物工程有限公司。硝酸纤维素膜和ECL化学发光试剂盒为Amersham公司产品。

1.3 带Myc表位的TRIM22-ΔSPRY真核表达质粒的构建

以本实验室先期构建的野生型TRIM22真核表达质粒[14]为模板,PCR扩增C端带Myc表位的SPRY结构域缺失的TRIM22基因,上游引物:5′-CAGGCTAGCATGGATTTCTCAGTAAAGGTAGAC-3′(NheⅠ),下游引物:5′-CTGAAGCTTTCACAGGTCTTCTTCAGAGATCAGTTTCTGTTCA

GGTCAGTTAGCCTTGCCT-3′(HindⅢ),下划线为酶切位点序列。对PCR产物和pcDNA3.1分别用NheⅠ和HindⅢ进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,用T4 DNA连接酶在16 ℃将目的基因片段插入pcDNA3.1。连接产物转化DH5α感受态细胞,挑取可疑阳性克隆,进行菌落PCR及双酶切鉴定,并将阳性克隆送测序。

1.4 细胞培养及转染

HepG2细胞在37 ℃、5% CO2条件下培养于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml链霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基中。利用磷酸钙沉淀法将目的质粒转染对数生长期的HepG2细胞。转染16 h后,用磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)洗2遍,然后加入新鲜培养基。

1.5 RT-PCR

收集HepG2细胞,用TRIzol试剂抽提细胞总RNA,并用DNaseⅠ处理1 h以清除残余DNA。取总RNA 1 μg进行反转录。反应条件:72 ℃ 5 min,42 ℃ 60 min,72 ℃ 5 min。采用Oligo(dT)18引物进行反转录,获得cDNA。PCR反应条件:94 ℃预变性4 min;94 ℃ 30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30个循环;然后72 ℃ 10 min终止反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶成像仪上拍摄成像并进行灰度扫描。

1.6 蛋白质免疫印迹法

收集转染后的HepG2细胞,置细胞裂解液中,经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离。电泳后,采用湿法(300 mA,90 min)转移至硝酸纤维素膜。经封闭液(5%脱脂奶粉-TBST)封闭2 h后,分别加入1∶500稀释的鼠抗c-myc单克隆抗体和1∶1 000稀释的鼠抗人GAPDH单克隆抗体(用TBST稀释),4 ℃过夜,漂洗3次,每次10 min。加入羊抗鼠IgG-HRP(TBST稀释1∶500),室温作用2 h,漂洗3次,每次10 min。用ECL化学发光法成像和显影。

1.7 间接免疫荧光分析

将HepG2以1×106个/ml铺于放有玻璃盖片的6孔细胞培养板中,培养48 h后通过磷酸钙沉淀法将TRIM22真核表达质粒转染HepG2细胞。48 h后将玻璃盖片取出,用4%中性甲醛固定30 min,PBS洗3次;0.2% Triton X-100冰上透化10 min,PBS洗3次;1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封闭1 h,PBS洗3次;与1∶500稀释的鼠抗c-myc单克隆抗体4 ℃孵育过夜,PBS洗3次;与1∶1 000稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗室温避光孵育2 h,PBS洗3次;与1∶500稀释的DAPI避光作用10 min,PBS洗3次;甘油封片后镜检、拍照。

2 结果

2.1 TRIM22 SPRY结构域缺失突变体的构建与鉴定

为研究SPRY结构域在TRIM22抗病毒过程中的作用,以本实验室先期构建的野生型TRIM22真核表达质粒为模板,PCR扩增C端带Myc表位、SPRY结构域缺失的基因片段,再将其克隆入真核表达质粒pcDNA3.1中。SPRY结构域缺失突变体(ΔSPRY)的菌落PCR和酶切鉴定结果进一步证实缺失SPRY结构域的TRIM22真核表达质粒构建成功、读码框架正确无误(图1)。

A: Identification of plasmid expressing TRIM22-ΔSPRY by colony PCR. 1, DNA marker; 2, TRIM22-ΔSPRY PCR products; 3, negative control. B: Identification of plasmid expressing TRIM22-ΔSPRY by restrict endonuclease digestion. 1, DNA marker; 2, pcDNA/TRIM22-ΔSPRY digested withNheⅠandHindⅢ.

图1TRIM22SPRY结构域突变体的构建与鉴定

Fig.1ConstructionofeukaryoticexpressionvectorforTRIM22-ΔSPRY

2.2 TRIM22的SPRY结构域对其转录的影响

为研究TRIM22的SPRY结构域对其转录的影响,将表达野生型TRIM22和SPRY结构域缺失的TRIM22真核表达质粒分别转染HepG2细胞,转染48 h后通过半定量RT-PCR检测mRNA表达水平。结果发现,突变型TRIM22在转录水平上与野生型TRIM22没有明显差异(图2)。

图2TRIM22的SPRY结构域对其转录的影响

Fig.2TheeffectoftheTRIM22SPRYdomainonitstrans-cription

2.3 TRIM22的SPRY结构域对其翻译的影响

为研究TRIM22的SPRY结构域对其翻译的影响,将带Myc表位的野生型和SPRY结构域缺失突变的TRIM22真核表达质粒转染HepG2细胞,转染48 h后利用抗Myc抗体进行蛋白质免疫印迹法检测。在约55×103和33×103处分别检测出野生型TRIM22和SPRY结构域缺失突变型TRIM22的表达,与预期的相对分子质量(Mr)相符,但两者在蛋白表达水平上并无明显差异(图3)。

图3TRIM22的SPRY结构域对其翻译的影响

Fig.3TheeffectofTRIM22SPRYdomainonitstranslation

2.4 TRIM22的SPRY结构域对其亚细胞定位的影响

为研究SPRY结构域对TRIM22在HepG2细胞中亚细胞定位的影响,将带Myc表位的野生型和SPRY结构域缺失突变的TRIM22真核表达质粒转染HepG2细胞,然后利用抗Myc抗体进行免疫荧光定位。结果发现野生型TRIM22主要定位在HepG2细胞核中,与我们以前所报道的在COS-7细胞中的结果相符[14],而SPRY结构域缺失的TRIM22则弥散分布在细胞质中(图4),提示SPRY结构域对TRIM22的亚细胞定位起关键作用。

A: Wild type TRIM22. B: SPRY domain deleted TRIM22.

图4TRIM22的SPRY结构域对其亚细胞定位的影响(×400)

Fig.4TheeffectofTRIM22SPRYonitssubcellularlocalization(×400)

3 讨论

TRIM蛋白属于RING蛋白家族,迄今已发现近70个TRIM家族成员都含有相似的RBCC结构序列,从蛋白肽链的N端到C端依次包含1个RING结构域、1或2个B-box结构域和1个卷曲螺旋结构域。60%的TRIM家族分子C端还有1个SPRY结构域[1]。许多TRIM家族分子在抗病毒固有免疫中起重要作用,研究最为深入的是TRIM5α,具有广泛的抗反转录病毒作用。恒河猴的TRIM5α分子可通过迅速降解病毒衣壳蛋白来抑制HIV-1的复制,从而抵抗HIV感染[3]。与TRIM5α在结构和功能上最为相似的是TRIM22。TRIM22基因的染色体定位于11p15,与TRIM5紧相邻,两者之间的距离仅为4.8 kb[15]。新近研究发现,TRIM22和TRIM5都表现出快速适应进化,即达尔文正向选择(positive selection)的特点,但由于两者具有极大的遗传相似性,所以不能同时进行达尔文正向选择[13]。多项研究表明,TRIM22亦可有效抑制HIV-1的复制,并与多种病毒感染有关,但TRIM22的抗病毒机制迄今还不清楚[5,10,11]。

60%的TRIM分子,包括TRIM22,在C端具有SPRY结构域。SPRY结构域的功能多样,与细胞因子信号转导的调节、RNA代谢及细胞内钙离子的释放等有关。在抗病毒免疫中,SPRY结构域可能与抗病毒特异性有关[16]。新近研究亦发现,TRIM5α和TRIM22分子进化的正选择氨基酸位点均位于SPRY结构域,提示SPRY结构域可能与TRIM22对病毒的识别有关[13]。为研究SPRY结构域在TRIM22抗病毒过程中发挥的作用,本研究对TRIM22的SPRY结构域进行缺失突变。由于基因突变可能影响其表达水平,我们将SPRY结构域缺失突变型和野生型TRIM22真核表达质粒转染HepG2细胞,然后比较其转录和翻译表达水平。结果显示,SPRY结构域的缺失并不影响TRIM22的转录和翻译水平,这为后续研究中排除基因表达水平差异的影响以及研究SPRY结构域在TRIM22抗病毒过程中的作用奠定基础。

研究表明多种TRIM分子以三聚体形式存在,TRIM蛋白的这种自我寡聚化能力有利于形成高Mr的复合物,从而构成显著的亚细胞结构,存在于胞核或胞质中[1],而TRIM分子的亚细胞定位往往与其功能的发挥密切相关。我们前期的研究发现,TRIM22主要定位于细胞核中,与其作为转录因子的功能相符。为研究SPRY结构域在TRIM22的亚细胞定位中所起的作用,我们将SPRY结构域缺失突变型和野生型TRIM22真核表达质粒转染HepG2细胞,利用免疫荧光技术进行亚细胞定位研究。结果发现,与定位在细胞核中的野生型TRIM22不同,SPRY结构域缺失突变体弥散分布在细胞质中,提示SPRY结构域对TRIM22的核内定位起关键作用,为进一步阐明该结构域在TRIM22抗病毒免疫中的作用和机制提供有益的启示。

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