肠道病毒71型分子生物学研究进展

刘丽艳,朱启镕

复旦大学附属儿科医院,上海201102

肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)自1974年首次报道以来,其感染已在世界范围内引起多次暴发与流行[1-9]。EV71主要引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD),在临床上与柯萨奇病毒A16所致的HFMD难以区分,也能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎等多种与神经系统相关的严重疾病。近年来,EV71的流行在亚太地区呈上升趋势,其中最令人关注的是该地区的EV71感染出现越来越严重的中枢神经系统症状。但其产生中枢神经系统症状的机制、病毒结构特征与毒力的关系目前还不明确,且缺乏有效预防其感染的疫苗。本文就此对EV71的分子生物学特征、分子流行病学及疫苗的研究进展等作一综述。

1 EV71的结构特征

EV71是小RNA病毒科(picornaviridae)肠道病毒属成员。病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构,无包膜和突起,直径24～30 nm,核酸为单股正链RNA。病毒颗粒的衣壳由60个亚单位构成,后者由4种衣壳蛋白(VP1～VP4)拼装成五聚体样结构。4种结构蛋白中,除VP4包埋在病毒颗粒外壳的内侧并与病毒核心紧密连接外,其他3种均暴露在病毒颗粒表面,因而抗原决定簇基本上位于VP1～VP3[10]。病毒颗粒没有类脂性的包膜,对去污剂、乙醚、脱氧胆酸盐和弱酸有抵抗力。此外,该病毒还能抵抗75%乙醇和5%甲酚皂溶液等常见的消毒剂。这些都决定了该病毒有较强的存活能力。EV71对高温(>50 ℃)及紫外线的抵抗能力较差。

EV71基因组为7 408个核苷酸组成的单股正链RNA,病毒基因组具有感染性。基因组仅有1个开放读码框架(open reading frame,ORF),编码含2 193个氨基酸的聚合蛋白,其两侧为5′和3′非编码区(untranslated region,UTR),3′ UTR含有长度可变的聚合腺苷酸尾巴〔poly(A)〕,5′端共价结合1个小相对分子质量(Mr)的蛋白(VPg)。聚合蛋白可进一步水解成P1、P2、P3前体蛋白,P1前体蛋白可进一步降解成VP1、VP2、VP3和VP4病毒衣壳蛋白。根据病毒衣壳蛋白VP1核苷酸序列的差异,可将EV71分为A、B、C基因型。目前除A基因型只有EV71原型株(BrCr株)外,B、C基因型又分别分为B1～B5、C1～C5亚型。P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白,包括2A(非特异性蛋白水解酶)、2B、2C、3A、VPg(5′端结合蛋白)、3C(特异性蛋白水解酶)和3D(RNA聚合酶组分)。病毒RNA正链和负链的5′和3′UTR中分别含有多肽翻译的起始信号和RNA合成起始信号。5′ UTR通常折叠成多个特异性的空间结构,这些结构通过与宿主细胞蛋白因子的结合,在起始病毒基因组RNA的合成和蛋白翻译过程中发挥重要作用。此外,5′ UTR结构还涉及病毒的宿主范围以及毒力等多个方面的功能。3′ UTR和poly(A)的功能目前尚不清楚。

2 EV71的毒力研究

EV71最初分离于有中枢神经系统症状的患者[1],可引起脑膜脑炎、脑干脑炎等严重中枢神经系统症状而导致死亡,也可引起疱疹性咽峡炎和HFMD等轻症疾病。因此,大量研究试图阐明EV71感染导致不同临床症状的机制。目前分子流行病学研究发现,EV71感染引起的临床症状与病毒的基因型并无关联,即不同基因型的毒株均可引起严重的神经系统感染或轻微的临床症状[7,11-15]。用3种基因型的EV71分别感染短尾猴,均出现中枢神经系统症状,说明各型毒株均具有神经系统毒性[16]。但部分研究发现,C1亚型毒株主要分离自无并发症的HFMD患者[12]或无症状者[17],认为C1毒株的VP1第170位氨基酸突变(A→V)[12]和5′ UTR与聚合酶编码基因的突变[17]是引起其毒力降低的原因。

EV71也是常见的致急性迟缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)的非脊髓灰质炎肠道病毒(non-polio enterovirus,NPEV)[18],因此推测EV71与脊髓灰质炎病毒具有相似的基因特征。脊髓灰质炎病毒的5′ UTR和VPl区存在对其神经毒性有决定作用的序列位点,但长期以来没有在EV71的5′ UTR和VPl序列中找到与毒力直接相关的位点[19]。通过对EV71和脊髓灰质炎病毒全基因组序列分析、比较发现,2种病毒的核苷酸和氨基酸序列存在较大差异(全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为58%和55%),EV71与预测的脊髓灰质炎病毒宿主受体结合蛋白的编码区也不具有相似性,且在全基因组也未发现高度相似区[20],提示EV71组织嗜性和神经毒力决定机制可能不同于脊髓灰质炎病毒。然而,由于研究仅限于对VPl区和5′ UTR序列的毒力分析,尚未通过定点突变进行动物实验验证,因此目前对EV71致AFP的毒力位点尚无定论。

其中，K为邻居列表的长度，若数据集较小，K可以与数据点数量相同；若数据集较大，可以只取前K个邻居组成列表，以平衡算法复杂度和结果精确度。当二阶邻近距离应用于t-SNE算法时，K可与t-SNE算法中的近似参数配合。

另外,柯萨奇病毒Al6和EV71的核苷酸序列及氨基酸序列的同源性分别为77%和89%,其主要临床症状也与EV71相同,为HFMD。但柯萨奇病毒Al6感染在临床上较少表现出严重的中枢神经系统症状。EV71和柯萨奇病毒A16感染的不同临床表现是否是因为存在神经毒性序列,目前尚无证据。研究还发现,EV71与其他肠道病毒一样,也存在重组现象[21-23],但与毒力关系还不清楚。对于点突变和重组这2种进化方式与EV71毒力之间的关系仍需进一步研究。

3 流行病学

自20世纪70年代发现EV71,已有3次EV71引起的大范围HFMD流行。第1次流行高峰于1971～1980年,发生在美国、澳大利亚、日本、瑞典、保加利亚、匈牙利和法国等欧美国家。1975年在保加利亚流行期间共有705例患儿感染,149例发生AFP,44例死亡[11]。第2次流行于1985年开始,在中国香港和台湾地区以及美国、巴西等地流行。第3次流行从1997年开始,在亚太地区大规模流行,如1997、2000和2003年在马来西亚流行。其中1997年马来西亚发生EV71大流行时,4～8月有2 628例发病,仅4～6月就有29例死亡;1998～2001年在新加坡流行,其中2000年9、10月报告HFMD病例达3 790例,死亡5例。

社会的需要是检验毕业设计质量的标准。研究制订适合新工科背景的教学质量标准，及时了解企业与市场的动态化需求，做好与毕业生的交流与反馈工作，开展多维度的毕业设计教学质量评价等的，是进一步提高毕业设计质量的阶梯。

我国自1981年在上海始见HFMD后,北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、西宁、广东等十几个省(市)均有HFMD病例报道。1998年在我国台湾省暴发了EV71引起的HFMD和疱疹性咽峡炎。在6月和10月的2波流行中,共监测到129 106例病例,其中重症病例405例,死亡78例,大多数为5岁以下的儿童,并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性软瘫和心肌炎。2000年5～8月在山东省招远市暴发了HFMD,市人民医院接诊患儿1 698例,其中年龄最小为5个月,最大14岁,3例合并暴发性心肌炎而死亡。2007年,全国共报告HFMD病例83 344例,死亡17例。仅山东省就报告了HFMD病例39 606例,北京、上海等大城市也有上万例HFMD的病例报告。2008年3月HFMD在安徽阜阳暴发并迅速蔓延到很多省份,当年全国共有488 955例,死亡126例。2009年疫情来得更凶猛、更严重,截至7月5日,仅山东省的累计报告病例就达85 301例,累计报告死亡病例44例。EV71感染导致的疾病给家庭和社会造成了沉重负担。

4 疫苗研究

虽然灭活病毒疫苗诱导的特异性免疫应答强度高于亚单位疫苗,但灭活疫苗存在安全性问题,尤其在免疫功能缺陷者尤为引人注意,因此有研究者探索了安全性更高的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的免疫效果。Chung等[25]分别把纯化EV71 VLP、变性EV71 VLP和热灭活EV71免疫BALB/c小鼠,比较三者的免疫效果,结果发现纯化EV71 VLP与其他两者可产生相当的总IgG水平和细胞免疫反应。此外,纯化EV71 VLP可刺激产生更高的中和抗体,且所产生的免疫应答能更好地保护新生小鼠(在接受1 000 LD50病毒攻击时,纯化EV71 VLP组新生小鼠的存活率为89%,变性EV71 VLP组和热灭活EV71组新生小鼠的存活率分别为45.5%和57.9%)。虽然,EV71 VLP具有良好的免疫效果,但要获得大量的VLP并进行大规模的纯化,目前还存在一定困难。

有效疫苗是预防传染病的最重要措施。目前已对EV71疫苗进行了大量研究。Wu等[24]比较了灭活病毒疫苗、VPl DNA疫苗和重组VPl蛋白亚单位疫苗诱导抗体产生及对哺乳期小鼠的保护作用。灭活病毒疫苗免疫母鼠所产新生鼠接受2 300 LD50病毒攻击时仍有80%可存活,而VPl DNA疫苗和重组VPl蛋白亚单位疫苗仅在新生鼠接受230 LD50时显示保护作用。在接受230 LD50病毒攻击时,VPl DNA疫苗免疫母鼠所产新生鼠的存活率为40%,重组VPl蛋白亚单位疫苗组为80%。3种疫苗产生的免疫应答也存在差异:灭活病毒疫苗免疫小鼠脾细胞产生高水平的白细胞介素4(interleukin-4,IL-4),DNA疫苗组产生高水平的γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)和IL-12,而VPl蛋白亚单位疫苗组则以产生IL-10和IFN-γ为主。总体来看,灭活病毒疫苗能诱导更强烈的体液免疫,且所产生的抗体被动传递给新生小鼠后能发挥更好的保护作用。

也有学者尝试利用转基因技术来开发EV71疫苗。2006年,Chen等[26]构建了VPl 基因表达载体,并将其转化至番茄。新鲜番茄汁中VPl蛋白量可达27 μg/g,将含有VPl蛋白的番茄汁作为口服疫苗接种BALB/c小鼠,可使小鼠产生VPl特异性IgA和IgG,且小鼠血浆能中和EV71,小鼠脾细胞也表现出增殖反应。Chen等[27]于2008年培育出VP71转基因小鼠,其分泌的乳汁中重组VPl蛋白含量可达2.51 mg/ml,经含VPl蛋白乳汁喂养的小鼠可产生EV71特异性抗体。因此,转基因技术有可能为EV71疫苗的研发开辟新途径。

2016年以后，国内旅游者行为研究发生了新的转向，研究内容呈现多样化的发展特点。在研究内容上，借鉴伦理学、社会学、人类学等相关理论，深化了对旅游者不文明行为的探讨；对旅游者的风险感知、具身体验研究逐步深入；旅游流动性的研究新视角不断发展深入，朝着学科交叉、跨文化研究的方向推进。但是，对于旅游者与社区居民的互动、社区居民的心理变化等的相关研究一直停滞不前，研究成果较少。在研究方法上，逐步实现了定量与定性分析的结合，能够运用田野调查、深度访谈等方法展现研究结果的科学性。但是，旅游者行为研究的理论概念、研究范式和学科体系尚未构建完全，未来需进一步完善旅游者行为研究的理论框架。

采用SPSS 19.0统计学软件处理数据，计量资料采用（±s）表示，进行 t检验，计数资料采用[n（%）]表示，进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

目前EV71感染仍是全球危害儿童较大的病毒性疾病之一,特别是近年来在东南亚,其危害越来越大。目前病毒结构与毒力的关系尚不清楚,缺乏有效预防EV71感染的疫苗。因此,该病毒分子流行病学的检测、病毒结构与功能关系的研究是当前的重要任务,加快疫苗的研发以控制EV71感染的暴发和流行刻不容缓。

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