尿液蛋白质分离检测及临床意义的研究进展

2010-03-20 20:13王洪礼综述魏殿军审校
天津医科大学学报 2010年4期
关键词:毛细管微量尿液

王洪礼,宁 莉 综述,魏殿军 审校

(天津医科大学第二医院检验科,天津 300211)

尿液蛋白检测及特性的鉴定对评价泌尿系统的功能和疾病非常重要。尿蛋白含量的检测方法很多,因检测方法和技术特性不同,其对尿蛋白的敏感性和特异性也不同。以往采用免疫化学方法检测尿微量白蛋白(mAlb)对肾脏损害作评价较尿常规、肾功能检查敏感,已被临床医生接受[1]。近来国外有报道发现用高效液相色谱(HPLC)法测定尿中非免疫活性白蛋白(INUA)能更早期地提示糖尿病肾脏损害,而采用常规免疫化学法不能测定之。因此,现阶段如何更好地分离和筛选尿蛋白检测指标对临床相关疾病的诊断具有非常重要的意义[2]。

1 尿液蛋白质的分类和临床特性

尿液中的蛋白质是非常复杂的,它们以多种形式存在。传统意义上,根据蛋白分子量的不同,将尿蛋白分为小分子蛋白(β2-微球蛋白、α1-微球蛋白、视黄醇结合蛋白)、中分子蛋白(白蛋白、转铁蛋白)、大分子蛋白(IgG、IgA、IgM、α2-巨球蛋白)。近年来,根据尿白蛋白的免疫活性又将其分为有免疫反应活性的白蛋白和非免疫活性白蛋白两类。而利用蛋白质组学方法可鉴定出来的尿蛋白质有171个,这包括5个男性特异性蛋白质——前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶前体、前列腺分化因子、精子形成蛋白Ⅰ和精子形成蛋白Ⅱ的前体,同时还鉴定出12个低分子量蛋白质(<10 kDa)。蛋白质组学方法鉴定出来的尿蛋白质大部分分子量范围为30~60 kDa,等电点范围为4~10[3]。

临床上最常用的尿液蛋白质的检测方法是免疫比浊法(RIA)。近年来发现HPLC法测定的白蛋白总量远超过RIA法测定的白蛋白浓度,因而推断有大量其他形式的白蛋白存在,其中包括非免疫活性白蛋白。非免疫活性白蛋白也是人体白蛋白成分,在尿液中大量存在,其分子与人血清白蛋白的大小相同,利用传统的抗人血清白蛋白抗体法不能检测出来。它们由多肽链组成,可被蛋白酶水解,其间通过二硫键和非共价键连接。这些白蛋白很可能是在通过肾脏的过程中形成,但也不排除血中含有少量该物质并被肾脏清除。研究表明,糖尿病人由无蛋白尿进展至微量蛋白尿期,尿中非免疫活性蛋白水平逐渐增高。Osicka等[4]对糖尿病人尿液非免疫活性白蛋白检测后发现该指标可将1和2型糖尿病人出现持续性蛋白尿的危险性预测分别提前3.9年和2.4年。

2 尿液蛋白质分离技术

尿液蛋白质分离通常采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳,此外用于蛋白质组分离的技术还有二维层析、荧光差异显示双向电泳、二维液相分离和同位素亲和标记等方法。

2.1 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE) 是使用最广泛的蛋白质分离技术,具有很高的分辨率,已经成为蛋白质组研究中的核心技术之一。其原理是根据蛋白质的等电点和分子量的差异使之在二维平面上分开。目前,最多可分离到11 000个左右蛋白样点。尽管双向电泳技术近几年已经取得了突破性进展,是当前蛋白质分离的最常用技术,但其本身还有一些难以克服的问题[5-6]。

2.2 毛细管电泳(CE) 其中应用较为广泛的是毛细管区带电泳(CZE)(依据不同蛋白质的电荷质量比的差异实现分离)、毛细管等电聚焦(依据蛋白质等电点不同在毛细管内形成pH梯度而实现分离)和毛细管电色谱(毛细管电泳和液相色谱的融合技术)。CE具有灵敏度高、稳定性好、分离自动化和成本消耗少等优点。毛细管电色谱是近年发展起来的一种新型微分离分析技术,它整合了毛细管电泳与微径柱液相色谱的优点,通过在填充微细颗粒液相色谱填料的微径柱色谱柱两端施加直流高压电场,达到其对痕量复杂生物及化学体系样品优越的分离能力。

2.3 二维色谱技术 二维色谱分离蛋白质有多种组合模式,第一维色谱多为离子交换色谱,也有凝胶过滤色谱,第二维通常是反相色谱,反相色谱采用反相有机溶剂作流动相,从而避免了盐等添加剂对后续质谱分析的影响。这种技术最大优势是可以避开相对分子质量和等电点的限制。作为一种新的技术,它的主要问题是分辨率和重现性尚不能与二维凝胶电泳相比。

3 尿蛋白检测的几种方法

由于总蛋白测定无法区分肾小球和肾小管型蛋白尿,Ellis和Buffone建议通过测定不同性质的尿白蛋白来确定肾小球来源的病理性。尿白蛋白检测包括传统的磺基水杨酸法、加热乙酸法、沉淀法、比浊法等。这些方法测定尿白蛋白具有一定局限性,如溴酚蓝作为染料结合剂测定尿白蛋白时稳定性差,即便在30 s内完成比色,受球蛋白的干扰仍较大;常规应用的免疫比浊法在测定<6mg/L的尿液白蛋白时不够敏感。理想的测量肾脏排泄蛋白质的选择能力时,应该用分子大小很不一致的蛋白质。散射免疫比浊法与免疫电泳技术已常用于尿液中各种蛋白质的定量;聚丙烯酰胺凝胶电泳可测量分子大小不一的蛋白质的大致比例;放射免疫试验用于尿液中白蛋白、IgG、β2-微球蛋白的定量测定;浊度法可测定尿液中各种血浆蛋白质。除常用方法外,本文再具体分析几种检测尿液蛋白质的新方法。

3.1 HPLC HPLC法测定尿液蛋白质具有高效和高的重现性,分析时间短,亲水的二醇键合相,实现蛋白质的良好回收率。使用宽的pH范围(pH3~8)色谱柱与流动相中有机改性剂和变性剂相兼容,消除了蛋白质的聚合,从而实现正确的蛋白质分子量测定。用于包括蛋白质单体、二聚体和聚合体的分离、脱盐、蛋白质分子量估算和改性蛋白质的分离。而新的HPLC检测方法比RIA法对早期高危病人的预测更可行、更敏感[7]。HPLC可检测尿液中免疫活性和非免疫活性蛋白质,检测出微量蛋白尿以下的尿蛋白水平,而常规检测方法不利于合并其他心血管疾病和代谢疾病的风险预测。

3.2 CZE CZE具有高效、快速、微量、多模式、经济、自动化及洁净等优点,是一种快速、高分辨、高灵敏的尿蛋白质检测方法[8]。碱性缓冲液中(pH=9.0)各种蛋白质都带负电,向阳极泳动。但在强力的电渗流的作用下,实际电泳中向阴极泳动。通过紫外检测器检测信号,最终将其制成电泳图谱。根据图谱中峰面积换算成蛋白含量。本法可在8min内将尿蛋白电泳分离,其中两个主要的峰1号峰为肌酐峰,3号峰为尿白蛋白峰。但毛细管电泳仪进样时精度较HPLC低,定量分析时以用内标法为宜[9]。

3.3 蛋白质组学的发展 蛋白质组学的发展主要依赖于高通量分离和分析技术的突破性进步。首先是液质联用技术的日益完善,使得蛋白质的高通量分析成为可能。其次是质谱技术,现已成为检测蛋白质分子的重要手段。最后是生物信息学的建立使得国际性的科学大协作得以形成。蛋白质组学研究的进一步深入,将对生命科学的发展起到重要的推动作用。尿蛋白质组学研究对于研究器官功能,尤其是肾脏和泌尿道功能具有重要意义。目前对尿蛋白质组已有一些研究,但这些研究所鉴定出的结果间差别很大。当前的低重现性是由样品本身的差异造成的,还是由样品处理、分离和鉴定方法不同造成的,或者这几方面因素都有作用,尚不清楚。另一方面,在鉴定出的尿蛋白质组中低分子量蛋白质(<10 kDa)很少,还需要进一步全面地进行分析[10]。

4 尿液中几种特殊蛋白质的测定意义

4.1 非免疫活性白蛋白 HPLC 法与RIA比较,可以检测所有完整的白蛋白片断,其检测微量白蛋白的量是RIA的2~3倍,HPLC比RIA对高危病人早期肾脏损伤的预测更敏感、更可行。临床医生完全可有把握的通过检验报告中精确的尿微量白蛋白对疾病严格定级并可以有效的监测治疗效果[11];同时还能够发现更多存在危险因素的患者,这对大范围人群的筛查非常有意义[12]。尿中非免疫活性白蛋白的检测对糖尿病肾脏疾病以及心血管疾病的早期诊断具有极大的临床意义[13]。

4.2 白蛋白 尿中白蛋白增加提示肾小球基底膜有病理通透性改变,是球性蛋白尿的主要标志;也是糖尿病及高血压并发肾脏损伤的早期指征[14]。持续性微量蛋白尿较尿常规和血清肾功能检查更敏感,也是反映肾小球功能的一个非常敏感的指标。有很多方法可以检测尿中白蛋白的含量,检测范围从极低含量的微量蛋白尿到含量极高的大量蛋白尿。新的患者经常来测定尿中微量白蛋白作为原始资料。如果阳性,应该每年测定尿中白蛋白:肌氨酸酐。所有肾脏疾病、糖尿病、高血压、代谢综合征的患者应该测定尿中白蛋白。

4.3 IgG 正常尿蛋白中白蛋白约占30%~40%,IgG占5%~10%,轻链5%,IgA3%,其余约40%为Tam-Horsfall等蛋白,在正常情况下,检测不出大分子蛋白,如IgD和IgM等[15]。有研究报道,临床试验对80例原发性肾小球肾炎进行尿Ig检测。尿IgG的检出率为86.25%,其中慢性肾炎和肾病综合征检出率为100%,84.5%>0.10g/L;急性肾炎和隐匿性肾小球疾病检出率为50%,有91.9%<0.10 g/L,两者差别有非常显著意义(P<0.01)。尿IgA检出率为32.5%,其中肾病综合征检出率为62.5%,急性肾炎和隐匿性肾小球疾病均未检出,尿IgM仅检出1例。

4.4 转铁蛋白(TRF) TRF对早期诊断糖尿病肾病具有良好的诊断价值,尿TRF是一种肾小球滤过功能不全的敏感指标。目前更多证据表明,糖尿病尿液白蛋白增加之前,尿液TRF已开始升高[16]。

4.5 视黄醇结合蛋白(URBP) URBP可早期敏感地反映肾盂肾炎的肾损伤程度,且URBP敏感性高于β2-MG。同时,URBP也是诊断高血压病早期肾损害的更敏感指标。肺心病患者存在肾功能的损害,动态观察URBP水平变化是判断其早期肾功能损害的敏感方法,能够早期发现肺心病患者的肾功能损害及程度[17]。

4.6 α1酸性糖蛋白(α1AGP) α1AGP又称血清类粘蛋白,是一种急性时相蛋白(acute phase proteins)。早期认为只有肝脏能合成和分泌,最近发现淋巴细胞也能分泌α1AGP。在组织损伤和感染、炎症反应时血清值增高,尤以慢性炎症为著,类风湿关节炎、烧伤、肿瘤时增加也较明显[18]。α1AGP水平与肝脏病变的范围和损害程度明显相关,动态观察可作为判断病情预后的一项生化指标;对肝炎、肝硬化和肝癌的鉴别诊断有一定的辅助意义。这种糖蛋白可大量结合碱性药物如喹啉,其浓度增加可减少血清中此类游离药物的浓度,影响药物的作用。

采用何种方式测定尿中蛋白质含量,应根据具体情况分析[19]。但对于通常的病人,为评价肾脏病理性损伤及其他器官对肾脏的影响,应在测定微量白蛋白的基础上,进一步选择其他蛋白质进行测定,尤其需要建立简便、快速、特异的非免疫活性尿蛋白的测定方法,及早预报肾脏病理损伤,为临床糖尿病的早期干预赢得时间,减少因肾脏损害而进入终末期糖尿病人的发病数。

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