脑外伤后转化生长因子-β对骨折愈合影响的研究进展

潘子翔 综述，井万里 审校

（天津市第一中心医院骨科，天津 300192）

在临床实践中观察到骨折合并脑外伤患者大量骨痂过度生长，骨折愈合速度明显加快[1]，甚至在肌肉中出现异位骨化。其具体作用机制尚不完全清楚，国内外学者对此进行了大量研究，试图找到其中原因。Bidner等[2]提出“假说”：大脑或垂体受损伤后可能分泌某种成分，也可能是脑损伤后炎症细胞的聚集分泌出某种促生长因子，由于血脑屏障的破坏致使这些物质能从脑中释放出来，作用于骨折局部而起作用。Bidner等的研究表明，脑损伤后血循环中可能有某种物质浓度升高，以致血清中促骨生长活性增加。转化生长因子β（TGF-β）在脑损伤合并骨折后血清中的动态变化过程似乎提示：TGF-β就是这样一种细胞因子。近年来国内外在这方面的研究已经引起了学者们的极大兴趣。本文就脑外伤后TGF-β对骨折愈合影响的研究进展作一综述。

1 TGF-β的生物学特性

1978年，De Larco等[3]在小鼠肉瘤病毒的转化细胞株培养基中找到一种多肽因子，它在表皮生长因子存在时能诱导正常大鼠肾成纤维细胞生长，并在软琼脂中形成克隆，这种因子被命名为TGF-β。

TGF-β是由两条肽链组成的二聚体，由二硫键连接而成，每一条肽链上有112个氨基酸，相对分子质量为25 000。氨基酸顺序特别保守，在C末端活性部分还有7～9个保守的半胱氨酸残基。TGF-β在合成初期是一种无活性的大分子复合物，经激活后产生由两条相同的12.5 kD肽链借二硫键连接而成的二聚体。目前已发现TGF-β1～β5 5种异构体。哺乳动物只含有 TGF-βl、TGF-β2、TGF-β3，它们结构相关，有60%～80%的序列同源，而且生物学功能相似，分别由特定细胞表达。内皮细胞及结缔组织表达TGF-β1，上皮细胞及神经元细胞表达TGF-β2，间质细胞表达TGF-β3。TGF-β以两种形式存在，大多数类型的组织和细胞合成和分泌的是无活性的TGF－β前体复合物，称潜活TGF－β，由TGF－β二聚体、潜伏相关蛋白和附加的二硫键结合蛋白组成，需经转化为成熟TGF－β才具有生物活性。实验研究表明，通过强酸强碱或变性试剂可使TGF-β活化，活化后的TGF-β通过存在于靶细胞膜上的TGF-β受体发挥生物学作用。

TGF-β来源广泛，可分泌TGF-β的细胞有巨噬细胞、血小板、上皮细胞、成纤维细胞、单核细胞、内皮细胞、纤维母细胞等；TGF-β广泛存在于动物的正常组织和转化细胞中，以骨组织和血小板中含量最高，在骨组织中又以TGF-β1含量最为丰富。

2 TGF-β的生物学功能

TGF-β是一种多功能调节因子，以自分泌、旁分泌和内分泌的方式，通过细胞表面的受体信号转导途径调控细胞的增殖、分化和凋亡，在许多组织的发育中发挥重要作用，可对众多的组织器官产生生物学效应，还参与成熟哺乳动物机体的免疫调节、细胞黏附及细胞外基质的合成和储存，因此TGF-β具有调节细胞生长、分化免疫功能，可促进细胞增殖，也可抑制细胞增殖抑制炎症，促进组织修复和胚胎发育等功能，与多种疾病的发生、发展和愈合有关，如与肿瘤的发生，与瘢痕发展和骨折的愈合有关。

根据细胞类型及其分化状态或实验条件不同，TGF-β既可刺激细胞的增殖，又可刺激细胞的分化，对细胞进行双向调节[4]。一般说来，对间充质来源细胞起刺激作用，而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用[5]。转染myc基因的Fischer3T3在表皮生长因子(EGF)存在时，TGF-β1抑制细胞生长，而在血小板衍生生长因子(PDGF)存在时，TGF-β1则促进细胞生长。TGF-β在不同条件下，对成骨细胞及成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重调节作用。1～10 ng/ml浓度的TGF-β可诱发大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成其特异性的Ⅰ型胶原及硫酸软骨素蛋白多糖；在0.4 nmol/L浓度下TGF-β可降低大鼠颅盖骨成骨细胞碱性磷酸酶的活性，减少成软骨细胞Ⅰ型胶原以及硫酸软骨素蛋白多糖的合成，此二种细胞亦由圆形或多角形转化为长形的成纤维细胞。正常情况下，组织重建是基质蛋白的合成和降解保持动态平衡的结果。TGF-β一方面通过促进成纤维细胞等产生葡萄糖、氨基酸的转运和糖酵解等代谢过程，导致胶原蛋白、非胶原糖蛋白、蛋白多糖等细胞外基质产生增加；另一方面TGF-β通过抑制基质金属蛋白酶（matrixmetall oproteinases，MMP）、胶原酶的表达和促进组织金属蛋白酶抑制剂、人成纤维细胞胶原酶抑制剂、纤溶酶原激活物等抑制剂的生成，减少异常合成的细胞外基质降解，从而增加细胞外基质在损伤组织、器官的沉积[6]。TGF-β对多数淋巴细胞具有免疫抑制作用，它能抑制T／B淋巴细胞的活化及分化、抑制NK细胞的活化、抑制巨噬细胞的吞噬能力从而使机体降低对肿瘤的监控能力。另外，肿瘤细胞分泌的TGF-β可造成免疫功能障碍使得肿瘤细胞逃避机体的免疫排斥。TGF-β还能促进血管内皮细胞增生，有利于肿瘤组织血管形成。TGF-β的这些作用主要是通过调节细胞周期因子、转录因子、黏附因子等环节而实现的[7]。

3 TGF-β在脑外伤中的意义

在神经系统中，TGF-β由巨噬细胞、小神经胶质细胞、星型胶质细胞分泌，正常含量很少。TGF-β是颅脑损伤修复的重要调节因子，它调节并促进细胞修复，当脑组织发生缺氧缺血后，体内TGF-β1mRNA有着规律性的表达过程。Lindholm等[8]研究表明，TGF-β1编码的mRNA在穿透性脑损伤的鼠脑皮质增高，TGF-β1在细胞损伤1 d后出现，4 d达高峰，可持续1周，其分布主要在损伤部位及其周围。有研究表明脑外伤病人伤后脑脊液中TGF-β1含量即升至最高水平，日后随时间的推移逐渐降低[9]。张凤歧[10]观察了79例不同病情的颅脑损伤患者早期不同时间段（1、3、5、7 d）的血清 TGF-β1 含量变化，结果发现重度颅脑损伤和中、轻型颅脑损伤患者血清TGF-β1浓度在伤后3 d降至最低水平，7 d后趋于回升。重度颅脑损伤患者不同时期的血清TGF-β1浓度分别明显低于中、轻度颅脑损伤患者同期检测结果。杨术真等[11]发现，患儿伤后24 h内血清TGF-β1即明显降低，3 d降至最低水平，伤后7 d趋于回升但仍低于对照组水平，并有显著性意义；同时发现，血清TGF-β1含量变化除与伤后不同时限有关外，还与患者的伤情程度有关，即伤情越重，血清TGF-β1下降越明显，并且持续的时间越长。表明血清TGF-β1参与颅脑损伤的病理生理改变，其水平变化反映着脑损伤的演变及修复过程。

颅脑损伤后，TGF-β1主要由胶质细胞和巨噬细胞诱导产生，作为一种重要抗炎因子，它对炎症细胞具有趋化作用，通过下调炎症递质肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及其受体而完成作用。体外研究表明，TGF-β1能调控细胞生长，抑制细胞外基质蛋白质的产生，TGF-β1对细胞移动，炎症和免疫反应有较明显的调节作用[12]。颅脑损伤后，聚集在损伤处巨噬细胞、血小板等释放TGF-β1。TGF-β1又促使炎症细胞向损伤区移动，放大其抗炎作用。体外实验发现，TGF-β1在增加神经数目的同时，并不影响树突的分支及数目，TGF-β1参与轴突的发生，使培养中的海马神经元轴突延长；TGF-β1对胶质细胞既有激活效应，也有抑制效应，其激活效应表现为在未成熟星形细胞，TGF-β1诱导胶质纤维性酸性蛋白表达和对小胶质细胞的化学吸引作用，最终增强纤维连接蛋白和胶原形成，促进结缔组织产生，在损伤修复的过程中起到重要的作用。在体内，TGF-β促进神经元的存活有多种途径，如刺激星形胶质周细胞产生和释放碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）等对神经元发挥营养作用，并促进神经元的存活和分化。损伤后小胶质细胞可上调或表达巨噬细胞特征，出现吞噬消除细胞碎片，并促进创伤愈合，在多种因子共存的情况下，TGF-β1具有促进有丝分裂的作用。Pasinetti等[13]对大鼠进行实验，同样发现与退化传入纤维相关的小胶质细胞、巨噬细胞能够使脑内损伤区有活性的星形胶质细胞转化生长因子mRNA上调，也可能影响纤维连接素mRNA合成。在穿透性脑损伤中，TGF-β1对星形胶质细胞增殖起抑制效应，表现为TGF-β1对小胶质细胞的细胞毒作用和MHC抗原表达的抑制，防止胶质瘢痕形成，对神经再生具有意义。同时，TGF-β1也是一种重要的调节细胞外基元（ECM）因子，它能促进ECM合成和抑制EMC降解。

4 TGF-β在骨折愈合中的作用

近年来，国内外学者在TGF-β促进骨折愈合作用方面进行了大量的动物实验研究，有些学者制造脑外伤合并骨折动物模型，研究其中TGF-β的表达规律以及和骨折愈合的关系。Joyce等[14]向新生小鼠大腿骨膜下局部注射外源性TGF-βl或TGF-β2，然后观察局部骨和软骨的形成，在基因水平测量发现TGF-β2有促进TGF-βl生成的作用，并且TGF-β2在体内比TGF-βl有更强的刺激骨形成的作用，同时发现TGF-β有刺激骨膜中间叶前体细胞分裂增殖的作用。许多研究也表明，TGF-β有促进脑外伤后原始骨痂生成加快的作用。马维等[15]研究了大鼠骨折以及骨折合并脑损伤后TGF-β1的变化情况。在单纯脑损伤组，术后第3天即有明显升高，第1周达到1个峰值，第2周开始下降，第3周后降至正常水平。在单纯骨折组，血清TGF-β1术后第3天开始增高，第1周达到1个初峰值，并一直持续至第4周，第5周降至正常水平。而脑损伤加骨折组则于术后第3天即有显著升高，为正常对照组的7倍，术后第1周时达到8倍。TGF-β1在脑损伤加骨折组的血清中动态变化的时间过程与单纯脑损伤后TGF-β1在脑组织局部表达的时间过程相一致。这一特征性变化与Bidner等[2]提出的“假说”相吻合。这说明TGF-βl在骨折愈合的前4周中起作用。王守君等[16]将SD大鼠分为两组，应用酶联免疫法和免疫组化方法对血清和骨痂进行分析，发现脑外伤合并股骨骨折的一组大鼠骨折合并脑外伤时血清中TGF-β1含量与骨折位点TGF-β1的表达高于单纯股骨骨折组。

骨组织中TGF-β来源于成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、软骨细胞，其中又以成骨细胞产生最多。TGF-β产生后很快进入钙化的骨基质中，其浓度约为其他组织的100倍。TGF-β首先以无活性的潜在型分泌，储存在矿化的骨基质中，不能直接与TGF-β受体结合。破骨细胞对骨基质进行水解时造成的局部酸性环境可激活TGF-β，激活的TGF-β既能抑制破骨细胞的活性，也可以刺激成骨细胞的合成作用以补充破骨细胞对骨的溶解。TGF-β的活性可被成骨细胞调节，因为成骨细胞能合成和分泌成纤维蛋白溶酶原活化剂及组织蛋白酶，而组织蛋白酶和纤维蛋白溶酶则能激活潜在型TGF-β。活化的TGF-β还可以反馈调节激活TGF-β的蛋白酶，使之达到一种平衡。另外，TGF-β本身也可以调节潜在型TGF-β的活性。

体外研究表明TGF-β能促进成骨细胞和软骨细胞的增殖与分化，促进成骨细胞合成I型胶原、骨联结素和骨桥蛋白，促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原，并与胰岛素样生长因子有协同作用[17]。Critchlow[18]研究发现，TGF-β的直接效应是促进骨膜中前成骨细胞的增殖，而不能启动骨膜骨细胞向成骨细胞或软骨细胞的分化。研究还发现，TGF-β对成骨细胞的生长有双向功能调节，即增殖早期呈负效应，而在基质形成及矿化期呈正效应。TGF-β对软骨的生长和分化也起着关键性的作用，且TGF-β呈剂量依赖性增强骨源性间充质细胞向软骨分化的作用。TGF-β还可以促进已被募集来的成骨细胞合成I型胶原、骨连结素和骨桥蛋白，促进基质蛋白的沉积及成纤维细胞合成胶原及纤维结合蛋白的作用，从而有利于骨基质的合成与积累。Chua等[19]在小鼠的实验中发现TGF-β能诱导血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达，通过VEGF而部分完成其促进骨折愈合的功能。

5 TGF-β的应用

近年来，随着TGF-β研究的不断深入，其在骨折愈合治疗中发挥的作用日益引起人们的重视，为此，各国学者对TGF-β应用于骨折治疗进行了大量的实验研究。

卢卫忠等[20]研究发现外源性TGF-β对骨折愈合有一定促进作用，并发现不同给药方式对骨折愈合作用的效果不同，以缓释系统法给予TGF-β的效果较强。研究表明，外源性TGF-β通过局部骨膜下注射，局部微量泵泵入、基因治疗等方法，可以刺激骨折局部成骨细胞的增殖，骨基质的合成，增加骨痂量，提高骨的抗弯强度，由此促进骨折的愈合。虽然有学者报道通过反复局部注射的方法成功地刺激成骨，也有学者报道与剂量和注射部位有关，但是因为TGF-β的半衰期比较短（约2min），所以通过简单的骨膜下注射的方法因效用短暂而不被广泛接受。同时由于TGF-β是多肽物质，在体内易扩散或被蛋白分解，作用于靶细胞的时间受限，加之骨缺损区生物力学的要求，故需要与一种载体复合，形成缓释系统，增强成骨效应。目前研究较多的TGF-β载体材料有胶原类、钙磷陶瓷类、脱矿骨及冻干脱矿骨类、聚酯类、透明质酸类、种植体类和复合类载体。

Ehrhart等[21]利用新西兰大白兔尺骨临界骨缺损模型验证明胶海绵复合TGF-β1缓释系统的局部成骨作用，以观察对术前放疗造成骨延迟愈合的治疗作用。该研究组发现复合有TGF-β1组的骨缺损中的成骨量明显超过未复合组，放疗组的成骨量与未放疗组相仿，体现出此种明胶海绵做为TGF-β载体的优良性能。Lee等[22]最近用胶原/壳聚糖微粒复合TGF-β1缓释系统治疗兔颅骨缺损，保持局部TGF-β1治疗浓度4周。运用扫描电镜技术观察到成骨细胞牢牢吸附在微粒上并呈现多层增殖，代表分化细胞功能的碱性磷酸酶活性也与对照组存在显著性差异，表现出极高的成骨活性。Szivek等[23]用TGF-βl附于磷酸钙陶瓷 (calcium phosphate ceramle，CPC)的表面，找出了骨与CPC结合时TGF-β1的最佳剂量。实验中用剂量为0.5mg/cm、1.0mg/cm和2.0mg/cm的TGF-βl，然后将复合体植入犬的腿部，在3、6和12周后处死实验动物，测量复合体和骨的机械结合强度，再从组织形态学进行评价，发现当TGF-βl的浓度在1.0mg/cm时，复合体与骨的结合强度最佳。Tieline等[24]将TGF-β1加入可吸收性自攻聚乳酸骨折固定螺钉，在鼠股骨缺损处用此钉固定。对照组中无 TGF-β1。1、3、6 周后，X 线片见加 TGF-β1组钉周骨缺损处有明显新骨形成，而对照组则无。由此表明聚乳酸螺钉亦可做为TGF-βl的缓释载体，在固定的同时，促进骨折愈合。

合并脑外伤的骨折愈合的机制非常复杂，是由多种因子参与的相互调节、协同作用的过程，如骨形态发生蛋白（BMP）、PDGF、TGF-β、bFGF、VEGF、成纤维细胞生长因子（FGF）等。TGF-β只能作为骨折愈合过程的重要因子之一而发挥作用，其他因子作用也不能忽视，虽然人们对TGF的作用有了一定的认识，依托目前的分子生物学技术和细胞生长因子特点，采用基因转染、组织工程技术等，无论是基础研究和临床应用都取得了一些进步，但对其在机体内的代谢过程、释放系统的调节以及各生长因子之间的相互关系尚有待进一步探讨和研究。由于TGF-β功能广泛，全身应用有可能导致严重的不良反应，而且许多体内和体外实验结论并不一致，甚至相反，同时基因技术本身尚不成熟，因此TGF-β离临床大规模应用，还有很长的路要走。

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