自噬在抗原加工呈递中作用的研究进展

李琼，吴淑燕，黄瑞

苏州大学基础医学与生物科学学院病原生物学系，苏州 215123

自噬(autophagy)的发现已有较长历史，但成为目前研究热点的根本原因是人们发现其在高等生物中的存在也是一种基本生命现象，与细胞恶变、机体炎症、生老病死和长寿等密切相关。自噬在机体的免疫、感染、炎症、肿瘤、心血管病、神经退行性疾病的发病中具有十分重要的作用，是当今生命科学继凋亡(apoptosis)后最热的研究领域之一。细胞自噬在机体固有免疫和获得性免疫中发挥重要作用，一方面通过溶酶体清除胞质内微生物，发挥天然抗感染免疫作用；另一方面可通过调节抗原呈递，在获得性免疫反应中发挥效应。本文综述了近年来自噬在抗原加工、呈递中作用的研究进展。

1 自噬与抗原呈递

自噬由Ashford和Porten在1962年首先发现，指来源于粗面内质网的无核糖体附着区的双层膜包裹部分胞质和细胞内需要降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，然后与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，降解所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[1]。根据底物进入溶酶体途径的不同，可将自噬分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)3类[2]。目前普遍认为自噬是一种防御和应激调控机制，适度的自噬对及时清除多余或损伤的细胞器、稳定细胞的形态和结构、维持细胞的正常功能和避免细胞衰老等至关重要。它既是体内的 “废品回收站”，也是“垃圾处理厂”；既可抵御病原体的入侵，又可保卫细胞免受细胞内毒物的损伤。自噬是细胞内的一种“自食”(self-eating)，而凋亡则是细胞的“自杀”(self-killing)，两者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚。一般说来，凋亡是程序化细胞死亡，自噬是程序化细胞存活，但过多或过少的自噬却危害细胞。在某些情况下，自噬可引起细胞死亡，因此早期也称自噬为Ⅱ型程序性细胞死亡。自噬通常发生在细胞处于压力情况下，如饥饿、去除细胞因子等，此过程涉及自噬体的形成。自噬检测的“金标准”是通过电子显微镜看到膜状结构的自噬体及其他相关亚细胞结构。最常用的方法是蛋白免疫印迹检测自噬标志物——微管相关蛋白1轻链3β(microtubule-associated protein 1 light chain 3β，MAP1 LC3β)中LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的转换，还可用荧光显微镜检测LC3点状聚集物的形成。由于LC3本身最终经溶酶体降解，因此需要应用一些溶酶体抑制剂联合检测。此外，2009年还发现存在非LC3依赖性途径的自噬[3]。

与在压力条件下为保证细胞存活非选择性摄取胞质成分而获得能量不同，免疫活化状态下的自噬具有特异性，在固有免疫和获得性免疫反应中发挥重要作用。绝大多数抗原进入机体后，需经抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)加工和处理，由主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子呈递给T细胞以激活获得性免疫。经典的MHC分子有2类：MHCⅠ类和MHC Ⅱ类分子。MHCⅠ类分子主要呈递通过蛋白酶体降解的产物——短寿的胞质、胞核蛋白和细胞器，如细胞周期素、内质网、线粒体等；而MHCⅡ类分子主要呈递通过溶酶体降解的产物。一般情况下，MHCⅠ类分子呈递内源性抗原，MHCⅡ类分子呈递外源性抗原。然而对MHCⅡ类分子-抗原肽复合物的研究发现，有相当部分的MHCⅡ类配体来源于胞质蛋白，甚至胞核蛋白，无法用经典的MHCⅡ类分子呈递外源性抗原来解释。最近研究发现，自噬参与了这种将胞质成分传递到内体和溶酶体的过程。

2 自噬与MHCⅡ类分子对抗原的加工和呈递

自噬对抗原呈递的重要作用主要表现在增强MHCⅡ类分子对抗原的呈递及对CD4+T细胞的活化。3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是目前已知最常见胞质来源的天然MHC Ⅱ类分子配体，可通过CMA降解，并能在自噬发生后存在于自噬体内[4]。GAPDH已在5种不同的MHCⅡ类等位基因的编码产物中分离到，而在MHCⅠ类中却从未发现，提示自噬底物负载至MHCⅡ类分子，由MHCⅡ类分子呈递。在树突细胞(dendritic cell，DC)、巨噬细胞和B细胞等能表达MHCⅡ类分子的专职性APC中，自噬蛋白8(autophagy protein 8，Atg8)或LC3(酵母的Atg8在哺乳动物中为LC3)与MHCⅡ类分子在结构上有50%～80%的重叠性，表明自噬参与了将抗原呈递给MHCⅡ类分子，由其加工后呈递至T细胞而引发获得性免疫反应[5]。用RNA干扰(RNA interference，RNAi)抑制自噬或抑制与自噬体形成相关的蛋白，MHCⅡ类分子呈递抗原的能力明显下降[6]。用自噬体标记蛋白研究模式抗原与MHCⅡ类分子的结合及呈递过程发现，自噬可使负载Atg8/LC3-流感病毒基质蛋白和Atg8/LC3-肿瘤抗原融合蛋白的MHCⅡ类分子呈递抗原的能力增强5～20倍[7]。抗原肽与突变型Atg8/LC3的融合蛋白不能增强抗原呈递作用。

细胞生物学研究为自噬参与MHCⅡ类分子处理内源性抗原肽的过程提供了有力证据。MHCⅡ类分子负载发生在晚期内体富含MHCⅡ类分子的腔隙(MHC class Ⅱ-containing compartment，MⅡC)，此时MⅡC具有多泡或多层形态，提示其与表现为多层膜结构的自噬体之间存在某种重要的联系。应用免疫电子显微镜，以胶体金作为标记物，观察到内体与自噬体的融合。当溶酶体降解被抑制时，该融合体保持稳定。通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)与自噬蛋白的融合物GFP-Atg8/LC3标记自噬体，发现GFP-Atg8/LC3和MHCⅡ类分子相邻定位于囊泡内膜上，是MHCⅡ类分子负载抗原肽与自噬体共定位的重要 证 据[8]。在土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)感染的巨噬细胞囊泡中，可观察到GFP-Atg8/LC3与MHCⅡ类分子共定位，进一步提供了自噬体和MⅡC融合的证据[9]。因此，自噬参与MHCⅡ类抗原呈递的过程为：自噬体与MⅡC融合→传递底物至晚期内体的囊泡膜→提供MHCⅡ类分子负载。

自噬对抗原呈递的重要作用除增强MHCⅡ类分子呈递和CD4+T细胞活化外，对于某些病原体还是必不可少的。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)蛋白85B抗原是预防分枝杆菌感染的一种重要候选疫苗抗原[10]。西罗莫司(rapamycin，RAPA)是诱导自噬的经典药物，激活自噬后能增强85B抗原与MHCⅡ类分子的结合，此过程需要活的结核分枝杆菌感染，并可被RNAi所致的atg6基因沉默所抑制。在感染的巨噬细胞中，RAPA可将结核分枝杆菌定位于自噬体中，并能增强体内被结核分枝杆菌感染的DC活化，从而刺激85B抗原诱导的特异CD4+T细胞活化，证明自噬参与了MHC Ⅱ类分子对抗原的呈递。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)为人类疱疹病毒，95%以上的成人呈隐性感染。在机体免疫力低下时，病毒会导致咽炎、上呼吸道感染和传染性单核细胞增多症等，并与多种恶性肿瘤的发生有关。EBV核抗原1(EBV nuclear antigen 1，EBNA-l)具有甘氨酸-丙氨酸(Gly-Ala)重复序列，可抑制蛋白酶体对病毒的作用，从而逃脱CD8+T细胞识别，但可被CD4+T细胞识别。在自噬过程中，EBNA-1抗原肽被降解后与溶酶体中的MHCⅡ类分子结合，呈递到APC表面以激活机体的抗病毒特异免疫应答[11]。在EBV感染细胞中，溶酶体酶的活性被抑制后，EBNA-l主要存在于胞质，只有小部分存在于溶酶体中。单磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)是一种荧光染料，可用作自噬泡的示踪剂[12]。MDC染色发现胞质中的EBNA-1与MDC重合；电子显微镜观察到EBNA-l被双层膜包裹，说明EBNA-l被自噬泡捕获后传递至溶酶体。抑制溶酶体的酸化过程或RNAi将atg12沉默，均可阻断EBNA-1的MHCⅡ类抗原呈递和CD4+T细胞克隆的形成[13]。以上实验反向说明，通过自噬传递了病原体的特异抗原，以供MHCⅡ类分子加工、呈递，并活化CD4+T细胞，从而启动机体的获得性免疫应答。

对自噬在内源性MHCⅡ类分子抗原呈递中的研究主要集中于经典APC，如巨噬细胞、DC和B细胞等，但自噬在非专职性APC中对抗原呈递也有作用。小鼠胸腺上皮细胞吞噬能力较低，但与胸腺细胞的阳性选择密切相关，其中存在的大量自噬可能参与了胞核和胞质中自身蛋白的处理以供MHCⅡ类分子负载[14]。此外，细胞自噬还可增强疫苗效果，如流行性感冒病毒抗原与自噬体膜表面蛋白LC3结合后，比单用抗原刺激引起更强烈的CD4+T细胞反应。自噬还能将胞质中复制病毒的中间产物呈递给含有Toll 样受体7(Toll-like receptor 7，TLR7)的内体以激活干扰素α(interferon α，IFN-α)，通过TLR7活化自噬[15]。

3 自噬与MHC Ⅰ类分子对抗原的加工和呈递

大量研究已证实，自噬主要参与MHC Ⅱ类分子对抗原的呈递，也可在经典和非经典MHCⅠ类分子的抗原呈递中起辅助作用。感染单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1，HSV-1)的巨噬细胞中，除经典的病毒多肽- MHCⅠ类分子复合体呈递抗原外，自噬也参与其中。HSV-1糖蛋白B在自噬体内被蛋白酶体降解后，与MHCⅠ类分子形成的复合体被呈递，进而激活CD8+T细胞。MHCⅠ类分子主要呈递内源性抗原，但如果APC自身不能处理抗原则从外界捕获并与MHCⅠ类分子结合后呈递给T细胞，此方式称交叉呈递(cross presentation)。最近研究发现吞噬细胞中MHCⅠ类和Ⅱ类分子交叉呈递抗原的过程——对死亡细胞的清除，精确地依赖于濒死细胞发挥自噬功能[6]。atg5和atg6缺陷细胞不能产生凋亡小体，不会被吞噬细胞吞噬，且不能释放溶血磷脂胆碱而募集巨噬细胞。这导致早期胚胎发育中不完整腔隙形成，凋亡细胞在atg5缺陷小鼠体内蓄积。此外，在鸡视网膜发育中，用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制自噬也会导致坏死细胞蓄积[16]。在小鼠中，自噬产生的ATP参与磷脂酰丝氨酸的表面呈递，同时为邻近细胞有效吞噬凋亡小体提供能量。因此，自噬通过促进吞噬细胞摄取濒死细胞，增强MHCⅠ类和MHCⅡ类分子的交叉呈递。

除参与经典的MHC分子对抗原的加工、呈递外，自噬还可直接传递病原体成分至溶酶体，使其降解并被免疫系统识别。它可能是通过促进病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)被细胞TLR识别来完成的。此外，非经典MHCⅠ类分子CD1d可在MⅡC获得其糖脂配体[17]。自噬体通常与MⅡC融合，溶酶体的水解作用还可对脂质进行处理，因此自噬可能通过传递糖脂配体给CD1d分子，随后被呈递给自然杀伤(natural killer, NK)T细胞，即能组成性表达NK1.1和TCR-CD3复合受体分子的T细胞，激活免疫反应。

4 结语

细胞自噬参与机体抵御病原体入侵的免疫防御过程，也是机体对抗病原体感染的第2道防线。研究发现，在人扁桃体炎和咽喉炎发作时，免疫系统有时无法抵挡病原菌入侵细胞，但一旦启动细胞自噬就能消灭这类细菌。深入探讨自噬在抗原加工、呈递中的作用机制，有助于阐明病原体的感染过程，最终为人类通过调控细胞自噬预防和控制感染的发生、发展提供新的思路和方法。

[1] Levine B, Deretic V. Unveiling the roles of autophagy in innate and adaptive immunity [J]. Nat Rev Immunol, 2007, 7(10): 767-777.

[2] Mizushima N. Methods for monitoring autophagy [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(12): 2491-2502.

[3] Nishida Y, Arakawa S, Fujitani K, Yamaguchi H, Mizuta T, Kanaseki T, Komatsu M, Otsu K, Tsujimoto Y, Shimizu S. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy [J]. Nature, 2009, 461 (7264): 654-658.

[4] Fengsrud M, Raiborg C, Berg TO, Strømhaug PE, Ueno T, Erichsen ES, Seglen PO. Autophagosome-associated variant isoforms of cytosolic enzymes [J]. Biochem J, 2000, 352 (Pt3) : 773-781.

[5] Rajagopal D, Bal V, Mayor S, George A, Rath S. A role for the Hsp90 molecular chaperone family in antigen presentation to T lymphocytes via major histocompatibility complex class II molecules [J]. Eur J Immunol, 2006, 36 (4): 828-841.

[6] Qu X, Zou Z, Sun Q, Luby-Phelps K, Cheng P, Hogan RN, Gilpin C, Levine B. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development [J]. Cell, 2007, 128(5): 931-946.

[7] Schmid D, Pypaert M. MHC class II antigen loading compartments continuously receive input from autophagosomes [J]. Immunity, 2007, 26 (1): 79-92.

[8] Zwart W, Griekspoor A, Kuijl C, Marsman M, van Rheenen J, Janssen H, Calafat J, van Ham M, Janssen L, van Lith M, Jalink K, Neefjes J. Spatial separation of HLADM/HLA-DR interactions within MIIC and phagosome-induced immune escape [J]. Immunity, 2005, 22: 221-233.

[9] Hrstka R, Krocová Z, Cerny J, Vojtesek B, Macela A, Stulík J. Francisella tularensis strain LVS resides in MHC II-positive autophagic vacuoles in macrophages [J]. Folia Microbiol, 2007, 52(6): 631-636.

[10] Jagannath C, Lindsey DR, Dhandayuthapani S, Xu Y, Hunter RL Jr, Eissa NT. Autophagy enhances the efficacy of BCG vaccine by increasing peptide presentation in mouse dendritic cells [J]. Nat Med, 20090, 15(3): 267-276.

[11] Leung CS, Haigh TA, Mackay LK, Rickinson AB, Taylor GS. Nuclear location of an endogenously expressed antigen, EBNA1, restricts access to macroautophagy and the range of CD4 epitope display [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(5): 2165-2170.

[12] Biederbick A, Kern HF, Elsasser HP. Monodansylcadaverine (MDC) is a specific in vivo maker for autophagy vacuoles [J]. Eur J Cell Biol, 1995, 66(1): 3-14.

[13] Paludan C, Schmid D, Landthaler M, Vockerodt M, Kube D, Tuschl T, Münz C. Endogenous MHC class II processing of a viral nuclear antigen after autophagy [J]. Science, 2005, 307(5709): 593-596.

[14] Mizushima N, Yamamoto A, Matsui M, Yoshimori T, Ohsumi Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker [J]. Mol Biol Cell, 2004, 15 (3): 1101-1111.

[15] Klionsky DJ, Abeliovich H, Agostinis P, Agrawal DK, Aliev G, Askew DS, Baba M, Baehrecke EH, Bahr BA, Ballabio A, Bamber BA, Bassham DC, Bergamini E, Bi X, Biard-Piechaczyk M, Blum JS, Bredesen DE, Brodsky JL, Brumell JH, Brunk UT, Bursch W, Camougrand N, Cebollero E, Cecconi F, Chen Y, Chin LS, Choi A, Chu CT, Chung J, Clarke PG, Clark RS, Clarke SG, Clavé C, Cleveland JL, Codogno P, Colombo MI, Coto-Montes A, Cregg JM, Cuervo AM, Debnath J, Demarchi F, Dennis PB, Dennis PA, Deretic V, Devenish RJ, Di Sano F, Dice JF, Difiglia M, Dinesh-Kumar S, Distelhorst CW, Djavaheri-Mergny M, Dorsey FC, Dröge W, Dron M, Dunn WA Jr, Duszenko M, Eissa NT, Elazar Z, Esclatine A, Eskelinen EL, Fésüs L, Finley KD, Fuentes JM, Fueyo J, Fujisaki K, Galliot B, Gao FB, Gewirtz DA, Gibson SB, Gohla A, Goldberg AL, Gonzalez R, González-Estévez C, Gorski S, Gottlieb RA, Häussinger D, He YW, Heidenreich K, Hill JA, Høyer-Hansen M, Hu X, Huang WP, Iwasaki A, Jäättelä M, Jackson WT, Jiang X, Jin S, Johansen T, Jung JU, Kadowaki M, Kang C, Kelekar A, Kessel DH, Kiel JA, Kim HP, Kimchi A, Kinsella TJ, Kiselyov K, Kitamoto K, Knecht E, Komatsu M, Kominami E, Kondo S, Kovács AL, Kroemer G, Kuan CY, Kumar R, Kundu M, Landry J, Laporte M, Le W, Lei HY, Lenardo MJ, Levine B, Lieberman A, Lim KL, Lin FC, Liou W, Liu LF, Lopez-Berestein G, López-Otín C, Lu B, Macleod KF, Malorni W, Martinet W, Matsuoka K, Mautner J, Meijer AJ, Meléndez A, Michels P, Miotto G, Mistiaen WP, Mizushima N, Mograbi B, Monastyrska I, Moore MN, Moreira PI, Moriyasu Y, Motyl T, Münz C, Murphy LO, Naqvi NI, Neufeld TP, Nishino I, Nixon RA, Noda T, Nürnberg B, Ogawa M, Oleinick NL, Olsen LJ, Ozpolat B, Paglin S, Palmer GE, Papassideri I, Parkes M, Perlmutter DH, Perry G, Piacentini M, Pinkas-Kramarski R, Prescott M, Proikas-Cezanne T, Raben N, Rami A, Reggiori F, Rohrer B, Rubinsztein DC, Ryan KM, Sadoshima J, Sakagami H, Sakai Y, Sandri M, Sasakawa C, Sass M, Schneider C, Seglen PO, Seleverstov O, Settleman J, Shacka JJ, Shapiro IM, Sibirny A, Silva-Zacarin EC, Simon HU, Simone C, Simonsen A, Smith MA, Spanel-Borowski K, Srinivas V, Steeves M, Stenmark H, Stromhaug PE, Subauste CS, Sugimoto S, Sulzer D, Suzuki T, Swanson MS, Tabas I, Takeshita F, Talbot NJ, Tallóczy Z, Tanaka K, Tanaka K, Tanida I, Taylor GS, Taylor JP, Terman A, Tettamanti G, Thompson CB, Thumm M, Tolkovsky AM, Tooze SA, Truant R, Tumanovska LV, Uchiyama Y, Ueno T, Uzcátegui NL, van der Klei I, Vaquero EC, Vellai T, Vogel MW, Wang HG, Webster P, Wiley JW, Xi Z, Xiao G, Yahalom J, Yang JM, Yap G, Yin XM, Yoshimori T, Yu L, Yue Z, Yuzaki M, Zabirnyk O, Zheng X, Zhu X, Deter RL. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes [J]. Autophagy, 2008, 4 (2): 151-175.

[16] Mellen MA, De la Rosa EJ, Boya P. The autophagic machinery is necessary for removal of cell corpses from the developing retinal neuroepithelium [J]. Cell Death Differ, 2008, 15(8): 1279-1290.

[17] Sullivan BA, Nagarajan NA, Kronenberg M. CD1 and MHC II find different means to the same end [J]. Trends Immunol, 2005, 26(5): 282-288.