人乳头瘤病毒基因分型方法的进展

朱邦勇，李伟

广西皮肤病防治研究所，南宁 530003

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种可侵犯人类上皮细胞，引起皮肤和黏膜组织良性及恶性病变(如宫颈癌)的病毒[1,2]，而且生殖道感染HPV的孕妇在分娩过程中可导致新生儿感染[3]。HPV有100多个型别，不同型别的生物学行为及致病能力各不相同。高危型[4](与宫颈癌和宫颈上皮内瘤病变有关)包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，共13种亚型；低危型(与外生殖器尖锐湿疣等良性病变有关)包括HPV 6、11、42、43、44，共5种亚型。HPV基因分型对HPV疫苗的研究、分子流行病学控制措施的制定、HPV感染的治疗及预后判断具有重要作用。HPV是一种双链环状DNA病毒。8个高度重叠的开放读码框架(open reading frame，ORF)由早期基因、晚期基因和1个不翻译的上游调节区3部分组成。早期基因编码E1～E7共7个早期蛋白，主要参与病毒复制、转录、翻译调控及细胞转化。其中E6和E7基因能使细胞从正常向恶性转化，其蛋白产物具有干扰抑癌基因的功能。E6能结合P53，并促进其降解。E7能结合并拮抗抑癌蛋白pRB，从而干扰其抑制细胞分裂和增殖的作用。晚期基因L1和L2分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。HPV各型有共同抗原，即属特异性抗原，存在于L1蛋白，与牛乳头病毒(bovine papillomavirus，BPV)有交叉反应。对HPV分子生物学特性的认识为分子诊断奠定了基础[5]。目前HPV分型方法主要有杂交法和以聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)为基础的分型法两大类。本文就这两类分型方法作一综述。

1 杂交法

1.1 直接杂交分析

直接杂交分析是最先用于HPV检测的分子诊断方法，包括原位杂交(insituhybridization，ISH)、Southern印迹法、斑点杂交法等。宫颈刮片或活检标本中HPV可应用ISH法检测，该法和(或)其他标志物可对感染样品中的HPV单独或共同定位，但HPV分型鉴定仍需不同型的特异性探针进行多次ISH分析。ISH法测定HPV的主要缺点是敏感度很低[6]。将HPV DNA从临床标本中直接分离出来后，采用Southern印迹或斑点杂交进行检测，达不到临床所需灵敏度，且操作繁琐、费时、耗力、需大量高度纯化的DNA，不适合临床HPV分型的检测和大通量临床样品的筛查，目前较少使用。

1.2 杂交捕获法

杂交捕获法Ⅱ(hybrid captureⅡ，HCⅡ)是美国Digene公司研究的HPV DNA检测技术，通过一种非放射性核素(同位素)信号放大系统，使标记的RNA探针结合HPV DNA，形成DNA-RNA杂交体；后者被微孔板捕获并与特异性单克隆抗体及化学发光底物结合，碱性磷酸酶作用底物发光，依据荧光强度半定量DNA，与荧光实时定量PCR法结果相吻合[7]。该技术使用2种特异性探针，低危型探针检测HPV6、11、42、43和44，高危型探针检测HPV16、18、31、33、39、45、51、52、56、59和68，不需要进行PCR扩增而直接检测。HCⅡ为目前唯一以商品形式提供的且有足够科学证据支持临床应用的检测系统，获美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)认证，已成为许多国家的标准方法并广泛应用于临床研究中。该法的缺点是只能进行高危与低危型分组鉴定，而不能进行个体基因分型；两组混合探针间存在的交叉反应也影响检测的准确性[8]。随着对HPV研究的深入，需要对HPV特定基因型进行鉴定，该法不能用于如型特异性疫苗或型特异性药物的研究和疗效观察。杂交捕获法Ⅲ(HCⅢ)是Digene公司研制的新一代捕获杂交法。同样采用RNA探针技术，使用一段带有生物素的寡核苷酸代替特异性抗体，将RNA-DNA杂交体固定在链霉素包被的孔中。HCⅢ能特异检测出靶序列中单个核苷酸的改变，从而使HPV基因型变异体的检测成为可能。但HCⅢ也是使用混合探针，故不能对HPV进行分型。

2 基于PCR的检测方法

PCR是应用最广泛的基因扩增方法，具有快速、方便、敏感度高、特异性好的优点。检测HPV DNA有2种不同的PCR方法，即通用和型特异引物PCR。目前认为以PCR为基础的检测方法是进行HPV DNA检测及分型的最好方法。

2.1 通用引物PCR

通用引物PCR是使用通用引物来扩增广谱的HPV，引物针对HPV基因的保守区域设计。确定这个保守序列需要来自每个HPV型别的许多序列。在HPV基因组中，L1区最保守[9]。目前有3种不同的通用引物设计方案用于扩增广谱HPV DNA：①在基因组保守序列区设计1对只完全匹配1种或几种HPV型别的引物，PCR必须在较低的退火温度下进行。②采用一组简并引物如MY09/11，PCR也必须在较低的退火温度下进行。该组引物中含有简并碱基，因在其合成时掺入某个核苷酸有很大的随机性，故很难保证各批引物间的均一性，从而影响扩增的效率和重复性。③在基因的同一位置设计几对正向/反向引物，这些引物不含简并碱基但含黄嘌呤，如SPF10、MY09/11及PGMY。因黄嘌呤可与任何碱基匹配，故合成的引物具有较好的重复性，且PCR可在优化的退火温度下进行。因此，无论对较新的HPV型别，还是对已知的生殖道HPV型别，PGMY和SPF10的扩增效率要比MY09/11高。此外，待扩增片段的大小也影响PCR扩增的效率。总的来讲，PCR效率随扩增片段的延长而降低。加之有些临床标本经过醛固定、石蜡包埋等处理后，DNA已遭不同程度的降解，不利于较大片段产物的合成。因此，在上述这些引物中，SPF10扩增HPV DNA的效率最高(65 bp)，GP5+/6+次之(150 bp)，PGMY位列第3(450 bp)，MY09/11则列最后(450 bp)[10]。

2.2 型特异引物PCR

应用某个HPV型别的特异性引物检测临床标本，必须单独进行多个型特异的PCR反应。为此Yamaguchi等重新设计了通用引物(E6CF4/E7CR3)和5种主要的高危型HPV型特异正向引物，建立了HPV PCR/微量荧光分析法。标本中总HPV DNA用该通用引物扩增后，经SYBR Green Ⅰ染色，以485/538 nm的激发/发射波长进行检测，根据荧光强度判断HPV的有无。若为阳性，再用5种型特异引物同时扩增该标本中的HPV DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，根据型特异PCR的片段大小，即可鉴定相应基因型；或分别用不同型特异引物扩增HPV DNA，再与检测总HPV DNA一样，鉴定标本中是否存在特定的HPV型别。该法工作强度大、费用昂贵、型特异PCR必须证明有效，而且无法检测新的HPV亚型。

2.3 荧光实时定量PCR

荧光实时定量PCR是近几年发展的技术，既保持了PCR灵敏、快速的特点，又克服了PCR存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点，此外还有重复性好、操作简便、价廉等优点。目前主要有单通道和多通道实时荧光定量PCR。单通道实时荧光定量PCR在反应中使用一种荧光物质示踪，技术难度相对较低，但每次反应仅能检测1个基因，无法实现一次反应检测多个基因。在HPV型别分析时，需重复对样本进行多次PCR操作，大大增加了工作量及检测成本，因此在HPV感染的临床应用中受到限制。多通道实时荧光定量PCR检测HPV DNA是通过多种具有不同激发/发射波长的荧光物质标记或通过特异性探针示踪，实现在同一反应管内对不同基因型别的检测[11]。目前国外已有成型试剂盒(AB Analitica的RQ-HPV-PCR试剂盒)上市，经国内600例临床试验研究，特异度达99.7%，灵敏度为100%，重复性好；分型的同时还可准确定量，结果直观、可靠、客观性强，适用于临床HPV感染筛查和宫颈病变程度预测以及患者术后疗效观察。

2.4 PCR扩增产物的检测和分析

对PCR产物进行的凝胶电泳或测序分析可用于HPV DNA的检测或分型。①PCR产物直接测序法：能检测所有型别，并可避免杂交反应所固有的交叉反应，是一种比较可靠的HPV基因分型方法，特别是可检测出少见型别或发现新的型别。但在同时分析多个扩增产物中不同的DNA序列时，该法不是十分灵敏，尤其是对HPV混合感染的临床样品。②PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)：用适当的限制性内切酶消化PCR产物，产生大小不同的DNA片段，再通过凝胶电泳分析这些片段，根据电泳带型可区分不同的HPV型别[12,13]。这种方法简单、易行，不需特殊昂贵的仪器和设备，费用低。但RFLP对PCR产物的特异性要求比较高，非特异性条带的出现会导致酶切后分型的不确定性；另外还需适当的限制性内切酶，对混合感染的临床标本分析更为复杂。③PCR的杂交分析：微孔板杂交或反向线性杂交法。将PCR产物同时与多个寡核苷酸探针固定在固相上，将其与液相中的PCR产物杂交，通过一次分析就可同时检出若干HPV基因型。因此，杂交分析是最常用的检测PCR产物序列的方法。型特异杂交法敏感度较高，一次可检测多个PCR产物，对多重感染的检测能力较高。缺点是只能检测已知的常见型，对未知型及变异型HPV无法检测，且不能排除杂交固有的问题(即有交叉杂交存在的可能性)。

3 基因芯片

基因芯片是指采用原位合成或直接点样的方法将DNA片段或寡核苷酸片段排列在硅片、玻璃等介质上形成微矩阵，检测样品用荧光分子标记后与微矩阵杂交，通过荧光扫描及计算机分析即可获得样品中大量的基因序列及表达信息，以达到快速、高效、高通量分析生物信息的目的。国外HPV DNA芯片可分析15种高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、69)和7种低危型(HPV6、11、34、40、42、43、44)[14,15]，用于宫颈上皮内瘤病变或宫颈癌患者的临床诊断或流行病学筛查，比细胞学方法更敏感、特异、快速。液相芯片体系是美国Luminex公司开发的一项专利技术，结合了流式细胞技术及基因芯片技术的优点，主要包括3个步骤：①探针分子的固定；②将这种标记好探针的球形基质与样品反应，探针可与相应的靶分子特异性结合，带有绿色荧光的报告分子也与靶分子特异性结合，对反应进行定量；③反应结果的检测。该法具有通量高、速度快、灵活性好、操作简便、不需洗涤、耗时短等特点。理论上Luminex法可检测1个样本中100种不同目的分子，35～60 min内可对96个不同的样本进行检测，灵敏度高、信噪比好，只需微量样品即可检测，且价格低廉，可广泛用于大规模的流行病学调查、临床样本筛查、治疗干预监视和疫苗效果评价[16,17]。

4 结语

随着分子生物学技术的发展，HPV分型方法不断涌现，好的方法要有操作简便、灵敏度高、特异性好、价格低廉和客观性强等特点。由于不同分型方法有各自的优点和不足，可根据不同需要，选择合适、有效的分型方法满足实验要求。HCⅡ检测方法虽然成熟，但灵敏度不高且有较高的漏检率等，需进一步完善。常规PCR需制样、扩增及检测等步骤，费时又费力。荧光实时定量PCR特异性强、灵敏度高、重复性好，分型的同时还可准确定量，结果直观、可靠。PCR扩增后进行测序和RFLP不仅可检测具体型别，还可检测所有型别，作一定改进后有较大的发展前景。HPV DNA芯片因具备快速、高效、高通量的分析能力，可广泛用于大规模的流行病学调查、临床标本筛查、治疗干预监视和疫苗效果评价。

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