壳寡糖纳米载体细胞内递送EGFR脱氧核酶的研究＊

李 丹，王 贝，林奕婷，靳 冉，刘志文，刘选明

（湖南大学生物学院，生物能源与材料研究中心，湖南长沙 410082）

脱氧核酶（DNAzyme，DRz）是一种能特异性结合并切割靶RNA分子的酶性DNA，具有高效的催化降解能力和反义靶向识别能力［1］，被广泛用于肿瘤、遗传病等疾病的研究.脱氧核酶作为一种新型的靶基因沉默手段，其最主要的问题之一是如何有效地进入靶细胞.因此，寻找一种相容性好、在生物体内能够稳定递送基因的材料在基因治疗中具有广泛应用的价值和意义.

作为壳聚糖的降解产物，壳寡糖（oligochitosan，COS）无毒、无副作用，具有生物粘附性、生物相容性和可降解性［2］.研究显示，COS能保护DNA免于被DNase I降解，证明了COS应用于基因载体的可行性与安全性［3］.同壳聚糖这种生物大分子相比，COS还具有许多独特的功能性质，如水溶性、抗菌性、抗肿瘤和免疫促进性等［4］.基于壳寡糖的纳米药物／基因递送系统已成为药物／基因治疗研究的热点之一.

EGFR是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一，在多种肿瘤组织中有高表达，与肿瘤的发生发展和生物学行为密切相关，被认为是肿瘤基因治疗的潜在理想靶点［5］.基于此，本文以COS为递送载体，以靶向EGFR的脱氧核酶为研究对象，建立了一种有效的纳米基因细胞内传递体系，并探讨其介导的脱氧核酶在肿瘤细胞内的生物学效应.

1 材料与方法

1.1 材料

Hela细胞（ATCC－CCL－2）在10%小牛血清（Gibco BRL公司）的RPMI 1640培养基（赛莫飞世尔公司）中进行常规培养.总RNA提取试剂TRIZOL和Taq酶等购自Invitrogen；逆转录试剂盒购自安比奥.

1.2 EGFR脱氧核酶的设计与合成

由NCBI的GenBank获取EGFR cDNA保守序列，按照文献［6］方法进行靶向EGFR的脱氧核酶的设计和筛选，获得序列EGFR－DRz：

上述序列由Invitrogen公司合成.其中，对序列的前后各三个碱基进行硫代磷酸化以增强其稳定性.

1.3 COS－EGFR DRz复合物的制备与表征

COS（金壳生化）用1%的醋酸洗涤，0.22μm的滤网过滤，冻干，用PBS（pH6.5）配制成20mg／mL的溶液，过滤灭菌［7］.在水溶液中，COS分子表面带正电荷，EGFR DRz分子表面带有负电荷，利用静电吸附加以震荡可形成COS－EGFR DRz复合物.无菌条件下在1mL 1640培养基中分别加入不同比例的COS溶液和EGFR DRz，置于摇床震荡10min即可.利用Zeta电位－粒度分析仪对COSEGFR DRz复合物的大小进行表征分析.

1.4 COS－EGFR DRz复合物的细胞转染效率分析

选对数生长期的Hela细胞，用含抗生素的无血清培养基以105个细胞／孔接种于6孔板内培养过夜，分别以COS和脂质体oligofectmineTM（Invitrogen）为递送载体，将FITC标记的EGFR DRz转染细胞，24h后收集细胞，70%冷乙醇固定过夜.PBS洗2次，用流式细胞仪检测带荧光的细胞比例.

1.5 COS－EGFR DRz复合物在细胞内的分布

选对数生长期的Hela细胞，按照步骤1.4进行转染，经过24h培养，D－Hanks清洗2次，DAPI染色，在激光共聚焦显微镜下观察复合物在细胞内的分布情况.

1.6 COS－EGFR DRz复合物对EGFR mRNA的切割活性检测

选对数生长期的Hela细胞，按照步骤1.4进行转染.24h后提取总RNA，逆转录，用半定量PCR的方法检测转染前后EGFR mRNA水平的变化.其中，EGFR上游引物序列为：5’－ctt gca gcg ata cag ctc aga－3’；下游引物序列为：5’－tcc tgg tag tgt ggg tct ctg c－3’，扩增产物长度为189bp.β－actin上游引物序列为：5’–tta gct gtg ctc gcg cta ctc tct c－3’，下游引物序列为：5’–gtc gga ttg atg aaa ccc aga cac a－3’，扩增产物长度为168bp.10μL反应体系加入dNTPs，上、下游引物（20 μmol／L）各0.2μL和Taq酶（4U／μL）0.2μL.反应条件为94℃40s，60℃30s，72℃40s，35个循环，最后1个循环72℃10min.RT－PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察.

1.7 COS－EGFR DRz复合物对细胞周期和细胞凋亡的影响

选对数生长期的Hela细胞，按照步骤1.4进行转染.24h后70%乙醇固定过夜，PBS洗2次，流式细胞仪检测细胞的周期分布和细胞凋亡.其中空白对照为不加任何转染试剂的正常培养条件下的Hela细胞.

2 结果与讨论

2.1 COS－EGFR DRz复合物表征分析

采用Zeta电位－粒度分析仪对COS－EGFR DRz复合物的稳定性和粒径进行分析.如图1所示，固定EGFR DRz的浓度为2μmol／L，当复合物中COS的质量浓度为0.4mg／mL时，放置24h后，其粒径没有发生显著变化，相对其他配比组要稳定，在本实验中我们选用此配比为最适配比.图2显示，脂质体包裹的EGFR DRz复合物粒径在240nm左右，尽管COS－EGFR DRz复合物的粒径略大，在500nm左右，但文献显示，当转染复合物的粒径在230～1 290nm范围内时对其转染效率没有影响［8］.并且，目前也并没有证据能直接证明粒径与转染率之间有相关性［9］.

图1 COS质量浓度梯度对粒径的影响Fig.1 The effect of COS concentration on nanoparticle size

图2 不同载体复合物的粒径分布图Fig.2 The size analysis of different DRz／carrier complexes

2.2 COS－EGFR DRz复合物的细胞转染效率分析

采用流式分析COS携带EGFR DRz进入细胞的递送效率.如图3所示，空白对照只有微弱的本底荧光，COS的转染效率为88.7%，与脂质体的转染效率（89.7%）非常接近.此外，当脂质体和COS共同转染EGFR DRz时，其转染效率在90%左右.结果表明COS是脱氧核酶的有效细胞内递送载体.

图3 流式细胞术对不同载体转染效率的分析Fig.3 The transfection efficiency analysis of different carriers by Flow Cytometry

2.3 COS－EGFR DRz复合物在细胞内的分布

采用DAPI染色实验进一步分析COS能否有效地递送EGFR DRZ到细胞内.图4是COS－EG－FR DRz复合物转染Hela细胞后的激光共聚焦结果，绿色荧光是FITC标记的EGFR DRZ，可以看出经壳寡糖递送的EGFR DRz成功地进入了细胞内，在细胞核与细胞质均有分布.并且，还可观察到部分细胞染色质浓缩，呈现浓聚的蓝色荧光，提示经EGFR DRz靶向识别的细胞发生了凋亡.

图4 EGFR DRz在Hela细胞内的分布（500×）Fig.4 The distribution of EGFR DRz in Hela cell（500×）

2.4 COS－EGFR DRz复合物在肿瘤细胞内的切割活性分析

采用半定量RT－PCR进一步分析COS－EGFR DRz复合物能否有效地切割靶分子.从图5可以看出，与无EGFR mRNA切割活性的control DRz相比，经脂质体或COS转染的EGFR DRz能明显导致EGFR mRNA表达水平降低，再次证实经COS递送的EGFR DRz能够有效地进入Hela细胞，并实现对靶基因的靶向切割活性.

图5 COS－EGFR DRz复合物在Hela细胞内的切割活性分析Fig.5 The cleavage activity analysis of COS－EGFR DRz complexes in Hela cell

2.5 COS－EGFR DRz复合物对细胞周期和细胞凋亡的影响

许多肿瘤都有EGFR的过量表达，并使其下游信号途径异常激活，最终导致细胞出现转化、增殖等现象［10］.研究显示，采用靶向EGFR基因的药物，能有效抑制EGFR的表达，降低肿瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡［11－12］.如图6所示，转染EGFR DRz之后，G1期细胞比例均有所上升，细胞被阻滞在G0～G1期，这与EGFR基因沉默后细胞周期的表现一致［13］，证明细胞凋亡确实由EGFR DRz所致.结合图7，在转染效率相似的条件下，COS组转染EGFR DRz的细胞凋亡率达到19.3%，高于脂质体组的13%，进一步证实了COS作为基因载体的有效性，也表明COS本身对肿瘤细胞的生长也有一定的抑制作用.此外，当递送control DRz时，COS组的凋亡率2.49%，仅为脂质体组5.97%的一半，说明COS对细胞的毒性比脂质体更低.

图6 流式细胞术分析细胞周期Fig.6 Cell cycle analysis by Flow Cytometry

图7 流式细胞术分析细胞凋亡Fig.7 Cell apoptosis analysis by Flow Cytometry

3 结 论

近年来，基于可生物降解的大分子多聚体的药物／基因递送系统的研究已成为生物医学领域的研究热点之一.壳寡糖作为一种天然的可生物降解的聚合物，来源丰富，理化性质相对稳定，具有多种生物学活性，已成为被广泛关注的生物医学材料.本文设计合成了靶向EGFR的脱氧核酶，以壳寡糖为递送载体，转染Hela细胞，有效地实现了EGFR DRz的细胞内递送和对目的基因的靶向切割.与经典转染试剂脂质体相比，壳寡糖不但具有与脂质体相同的转染效率，并由于其本身具有抗肿瘤作用，因而对细胞的毒性更低.因此，壳寡糖作为一种潜在的、有效的脱氧核酶递送载体，不仅为基因治疗提供了一种新的手段，同时其本身所具有的多种生物学特性也丰富了药物／基因载体所发挥的作用.

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