人参皂甙Rg1和Rb1抗运动性中枢疲劳的实验研究

冯毅羽中 潘华山 卞伯高 赵自明 陈楚杰

（1.广州中医药大学，广东广州510006;2.广东省中医研究所广东广州510095）

近年来，随着中枢神经系统 （CNS）生理学研究的深入，中枢神经系统在疲劳中的作用越来越受到学术界的关注，中枢神经系统功能的紊乱是运动性疲劳产生的重要原因之一。相关研究证实，神经递质、神经调质、代谢产物的变化都对机体产生主要影响[1]。而中医认为运动性疲劳的主要病机是气虚阳弱，人参具有大补元气之效。本研究根据 “虚则补之”的基本原理，选用中药人参提取物人参皂甙Rg1和Rb1，对运动性疲劳大鼠进行灌胃治疗，考察大鼠中枢神经递质5-羟色胺 （5-HT）、γ-氨基丁酸 （GABA）、多巴胺 （DA）和乙酰胆碱（Ach）含量的变化，探讨人参皂甙Rb1和Re抗运动性中枢疲劳的效果和作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，180～220g，广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号:SYXK（粤）2008-0085，使用动物质量合格证明编号:0031686。于广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室内进行实验，常规分笼喂养，自由饮水进食，动物室内温度21～24℃，相对湿度40～55%，室内空气流通，光照时间l2 h。

1.2 药品、主要试剂与仪器

实验药品人参皂甙Rg1和Rb1均由上海同田生物技术有限公司提供，临用时用生理盐水按0.1ml/kg体重配成合适浓度后给药。5-HT、GABA、DA和Ach标准品，由AMRESCO公司提供;其它化学试剂均由广州新康医学试剂公司提供，均为分析纯。上述所有试剂均在有效期内使用。主要仪器有LC6A型岛津高效液相色谱仪及其检测器，ZH-PT动物实验跑台机。

1.3 运动疲劳模型的复制与分组方法

40只雄性SD大鼠，随机均分为人参皂甙Rg1组 （50 mg/kg）、人参皂甙 Rb1组 （50 mg/kg）、模型组 （0.1ml/kg生理盐水）和空白组 （等容量生理盐水.），每天上午8时灌胃一次，1 h后将空白组放回笼中常规喂养，其余各组均进行中等运动强度的水平跑台运动，速度为15 m/min，坡度0°，跑台20 min，间歇40 min，再跑台20 min，每天一次，连续14天。大鼠每两天称重一次，按照新体重调整灌胃量。

1.4 脑组织取材和匀浆制备

沿大鼠第一颈椎处剪断脊髓，沿枕骨大孔与大鼠耳缘上连线处剪开颅腔，取完整全脑，用4℃生理盐水清洗，滤纸吸干，立即置于放有冰块的小盘内，参照大鼠脑立体定位图谱及文献介绍，在冰面上迅速分离下丘脑，称重后-180℃保存。从下丘脑取新鲜冰冻的脑组织，电子天平称重，加冰冷的0.1mol/L高氯酸，冰浴下制备脑组织匀浆，4℃，14 000×g离心20 min，取上清液，0.2μ m滤膜滤过、分装，-80℃冷藏。

1.5 脑组织中枢神经递质的测定

1.5.1 下丘脑5-HT和DA含量测定方法

C18柱 （4.6 mm ×250 mm ，5μ m），LC-10AD泵，SIL-10A自动进样器，样品量20μ L，流动相∶甲醇∶水 =40∶60，含 0.028 g/L EDTANa2，0.15 g/L SDS，0.2ml/L H2SO4，pH:2.5-3;流速:1.0 mL/min;CTO:10AVP，柱温18℃，压力为160kgf/cm2。L-ECD-6A电化学检测器，CLASS-LC10 VER1.63工作站，以每克脑组织中递质含量表示 （ng/g）。

1.5.2 下丘脑GABA含量测定方法

色谱条件:色谱柱:锂柱10 cm×4.0 mm，柱温:77℃，流动相:锂缓冲液，流速14 ml/h;茚三硐显色剂，将二甲亚砜与茚三酮配制成茚三酮显色剂，流速:10 ml/h，进样量:1000μ l，比色波长:570nm，GABA含量以每克下丘脑组织中GABA的量 （μ mol/g）表示。

1.5.3 下丘脑Ach含量测定方法

取上述制备的下丘脑匀浆上清液，以Na2HPO4（100 mmol/L）、5-HT四甲基氯化铵（0.5 mmol/L）、辛基磺酸钠 （2.0 mmol/L）和0.005%“MB”试剂为流动相，重蒸去离子水定容，磷酸 （85%）调pH值为8.00。色谱条件为:ESA582型二元泵体系、ESA ACH-3色谱柱 （150×3 mm I.D.）、进样量 10μ L、流速 0.35 mL/min。检测条件为:5600A型电化学检测器、ESA柱前酶反应器、ESAACH-SPR、M5040型分析电极、铂工作电极、固态钯参比电极;电势为+300 mV。结果以每克组织中Ach含量 （mg/g）表示。

1.6 统计方法

采用单因素方差分析，组间均值比较采用SNK法，方差不齐时组间均值两两比较采用Dunnett T3法。以上数据均由SPSS15.0进行统计学分析。α=0.05。

2 结果

各项结果见表1。

表1 人参皂苷对运动性疲劳模型大鼠下丘脑各指标含量的影响

2.1 人参皂甙Rg1和Rb1对运动性疲劳模型大鼠下丘脑5-HT含量的影响

与模型组比较，空白组、人参皂甙 Rg1组和Rb1组下丘脑5-HT含量均有显著降低 （均有P＜0.01）;与人参皂甙Rg1组比较，人参皂甙Rb1组下丘脑5-HT含量有显著性降低 （P＜0.05）。

2.2 人参皂甙Rg1和Rb1对运动性疲劳模型大鼠下丘脑GABA含量的影响

与模型组比较，空白组、人参皂甙 Rg1和Rb1组下丘脑GABA含量均有显著降低 （均有P＜0.01）;与人参皂甙Rg1组比较，人参皂甙Rb1组下丘脑GABA含量有显著性降低 （P＜0.05）。

2.3 人参皂甙Rg1和Rb1对运动性疲劳模型大鼠下丘脑DA含量的影响

与模型组比较，人参皂甙Rg1组下丘脑DA含量有显著性升高 （P＜0.05），空白组和Rb1组下丘脑DA含量均有显著性升高 （均有P＜0.01）;与人参皂甙Rg1组比较，人参皂甙Rb1组下丘脑DA含量有显著性升高 （P＜0.01）。

2.4 人参皂甙Rg1和Rb1对运动性疲劳模型大鼠下丘脑Ach含量的影响

与模型组比较，空白组、人参皂甙 Rg1组和Rb1组下丘脑Ach含量均有显著性升高 （均有P＜0.01）;与人参皂甙Rg1组比较，人参皂甙Rb1组下丘脑Ach含量有显著性降低 （P＜0.05）。

3 讨论

3.1 运动性中枢疲劳与中枢神经递质

神经递质是一类在人体内负责传递神经信息的物质，中枢神经系统中各种神经元间的信息传递是由这类物质来完成的。关于中枢疲劳机制的一个重要学说是长时间运动时中枢神经递质改变以及不同递质 （兴奋性和抑制性）之间相对平衡的破坏诱导了疲劳的发生[2]。新近的研究表明，运动性疲劳的发生主要和抑制性神经递质5-HT与GABA、兴奋性神经递质DA与Ach四种神经递质的改变密切相关。其主要机制是:1）激烈长期运动时脑干和丘脑的5-HT明显升高，激发倦怠、食欲不振、睡眠紊乱等疲劳症状[3]。主要原因是随着运动时间的延长血浆游离脂肪酸 （FFA）和支链氨基酸（BCAA）氧化增加，血浆中游离色氨酸 （f-Trp）的浓度相对上升，f-Trp/BCAA比值增加，进而引起进入脑内的f-Trp增多，而f-Trp是合成脑5-HT的前体，故5-HT也随之增加[4]。2）在长时间运动后脑中抑制性氨基酸GABA的含量会升高，其原因在于一方面随着去甲肾上腺素释放的减少、ATP含量的下降，对谷氨酸脱羧酶的抑制作用减少，而造成GABA生产的增多;同时，疲劳时琥珀酸半醛脱氢酶活性下降，GABA氧化强度减弱，在脑中堆积[5]。3）多巴胺能作用是调节肌紧张，使机体做好进行运动的准备。而超常运动期间多巴胺活性减弱使其控制运动的能力下降，并通过运动协调的降低导致运动性疲劳的出现[6]。4）Ach是人体内普遍存在的神经递质，与记忆、意识和温度调节等有关。Ach的合成是由乙酰辅酶A（CoA）和胆碱在胆碱能神经元的标志酶-胆碱乙酰化酶作用下产生。而长时间运动会耗竭胆碱，导致Ach难以合成，进而产生疲劳[7]。

3.2 中医对运动性疲劳的认识

中医典籍中并无 “运动性疲劳”的论述，但与形体过用产生的疲劳及其相关病因病机的记载颇多。在中医看来，运动性疲劳本属过于劳动形体而产生的全身倦怠和精神困倦的生理病理过程[8]。如 《素问》中提出 “持重远行，汗出于肾;疾走恐惧，汗出于肝;摇体劳苦，汗出于脾。故春夏秋冬，四时阴阳，生病起于过用，此为常也。”汉代张仲景在 《金匮要略》中提出，疲劳与 “虚劳病”同类，认为疲劳的病机为气虚所致，有 “劳则气耗，劳则喘息汗出，内外皆越，故气耗矣”的论述。而 《千金方》中将 “劳”分为五劳，即肺劳、肝劳、心劳、脾劳、肾劳。现代中医研究认为，运动性疲劳是由于强力运动导致脏腑正常机能下降，出现喘息、大汗出、疲乏等表现，其机理是过劳常劳其形体，伤其脏腑、神志，耗损大量阳气、精血、津液，造成阴阳失和的状态[9]。现代中医研究虽然对运动性疲劳的改善提出了补肝肾、补脾肾、健脾胃、扶正理气等等诸多不同的方法，但大多数研究者都认同“虚则补之”的治法，即以进补的方式改善脏腑功能、促进疲劳的恢复。

3.3 人参皂甙Rg1和Rb1抗疲劳的疗效与机制

《神农本草经》把人参列为上品，有 “主补五脏、安精神、止惊悸、除邪气、明目、开心益智”的记述。现在研究表明人参皂甙是人参生理活性最重要的有效成分，从植物人参和西洋参中已分离出20余种皂甙。根据中医理论 “虚则补之”，可以选择人参及其主要提取物人参皂甙进行运动性疲劳的防治研究和运用。以往研究表明[10～14]，人参皂甙Rg1和Rb1是人参促智的主要有效成分。人参皂甙Rg1具有抗氧化、抗衰老，减轻神经功能损伤的作用，人参皂甙Rg1和Rb1均具神经营养和选择性神经保护作用，可促进神经元突触再生、增强胆碱能神经元抗损伤、保护谷氨酸诱导的神经细胞死亡率的作用、降低大鼠中风病急性期缺氧、缺糖再给氧损伤神经和星形胶质细胞等死亡率。本实验通过对中等强度的跑台运动复制的运动性疲劳模型大鼠中枢神经递质5-羟色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺和乙酰胆碱含量的测定，发现人参皂甙 Rg1和Rb1均能有效的降低下丘脑5-HT和GABA的含量，提高DA和Ach的含量;和人参皂甙Rg1比较，人参皂甙 Rb1在降低5-HT和GAGB含量、提高DA含量方面效果更优，但在提高Ach含量方面效果相对较差。总的说来，人参皂甙Rg1和Rb1均能改善运动性疲劳状态下中枢神经递质紊乱的情况，从而对中枢神经系统产生保护作用，达到抗中枢疲劳的效应，但人参皂甙Rb1的效果相对更优。

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