人巨细胞病毒皮层蛋白 pUL23与宿主蛋白IGFBP4相互作用的鉴定＊

肖小平, 周天鸿, 宫君原, 杨丹丽, 员月明, 李月琴, 邹 奕, 张 欣, 李弘剑

(暨南大学生命科学技术学院生物工程学系,广东广州 510632)

人巨细胞病毒 (human cytomegalovirus,HCMV)是一种重要的条件致病病原体,属疱疹病毒科乙组疱疹亚科,为双链 DNA病毒,在人群中感染非常普遍,为常见人体感染病毒,多数可长期带毒成为潜伏感染者[1]。在新生儿[2]、器官移植、肿瘤、艾滋病等免疫低下人群中,HCMV疾病的发病率和病死率都很高,是器官移植失败和受体死亡的重要原因[3-5]。HCMV病毒颗粒由至少 40种蛋白组成,包含包膜蛋白(envelope),皮层蛋白 (tegument),核衣壳 (capsid)[6]。皮层蛋白参与病毒颗粒的形成[7,8]、病毒运输[9]、免疫调节[10-12]以及转录激活过程。对编码皮层蛋白的基因进行无义突变,研究重组病毒的表型,发现有些皮层蛋白对于病毒复制或者高效复制是必须的。也有些基因对于病毒在体外复制是非必须的[13-15]。UL23是病毒的非必须基因,美国加州大学柏克利分校 (Berkeley)L IU实验室在研究人巨细胞病毒 Towne病毒株基因组功能时,发现缺失UL23的病毒株的生长能力比野生型强 10倍左右,作者推测,UL23可能作为一个生长抑制因子起作用。这些抑制因子可能会限制或阻止病毒的复制水平,使其不会严重破坏组织或使宿主死亡,而且,它们可能也会抑制裂解性复制至低水平或者停止复制,这样, HCMV才能持续、潜伏感染[15]。

目前对UL23的了解仅限于知道UL23可以编码蛋白质 pUL23,是病毒的 tegument蛋白,在细胞内大致定位在核周边[16]。本文从研究与 pUL23相互作用的宿主蛋白入手,筛选能与 pUL23相互作用的宿主蛋白,为进一步阐明 pUL23发挥功能的分子机制提供依据。

材 料 和 方 法

1 材料

Towne病毒株、质粒 pcDNA3.1(+)、质粒 pcDNA3.1(-)、pGEX-4T1、原核表达菌BL21、HFF细胞、COS7细胞均为本实验保存。Matchmaker GAL4 yeast two-hybrid system 3和人胚肾 cDNA文库均购自 Clontech;glutathione-Sepharose beads购自 Novagen;protein G Plus/protein A agarose suspension购自Invitrogen;HA鼠单克隆抗体购自美津公司;FLAG兔多克隆抗体购自北京西美杰公司;polyfect transfection reagent转染试剂购自 Qiagen;酵母质粒抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒均购自 Omega;一步法 RT-PCR试剂盒、限制性内切酶均购自 TaKaRa。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗鼠、羊抗兔Ⅱ抗、Cy3标记的羊抗兔Ⅱ抗均购自西美杰公司;R IPA裂解液、PMSF购自碧云天公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;PVDF膜购自Bio-Rad。

2 质粒构建

2.1 原核表达载体 pGEX-4T1-IGFBP4的构建以人胚肾 cDNA文库质粒为模板,根据 GenBank上公布的 IGFBP4序列(RefSeq号:NM_001552),采用软件Primer Premier 5.0分析,设计 IGFBP4上、下游引物。P1:5’-AGGAATTCGCCACCATG ACCCAG AATCTGGGG AGTGA-3’;P2:5’-GGGCTCG AGGGCTGGTCCTAGGCCTCCTGTTC-3’。PCR方法扩增IGFB P4的 CDS,下划线分别代表 EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点,PCR产物电泳后经胶回收试剂盒回收目的产物,进行 EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切,使用纯化试剂盒纯化酶切产物,与经过 EcoRⅠ和 XhoⅠ酶切的pGEX-4T1连接,转化 E.coliDH5α感受态中, pGEX-4T1-IGFBP4重组子经 PCR鉴定、酶切鉴定成功后,将此送往华大基因科技有限公司测序。

2.2 构建 pcDNA3.1(+)-FLAG-UL23 FLAG标签序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列为:5’-GATCCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGTGAT-3’;互补链:5’-CTAGATCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCG-3’。下划线为 SalⅠ、XbaⅠ黏性末端,使用前应退火。以 EcoRⅠ、SalⅠ双酶切 pGBKT7-UL23,使用纯化试剂盒纯化酶切产物。UL23片段以 GenBank上公布的 tegument protein UL23[human herpesvirus 5](RefSeq号为 NC_006273)序列为模板,使用软件Primer Premier 5.0分析,设计 PCR上、下游引物 P1、P2。P1:5’-AAGG AATTCCGGATGTCGGTAATCAAG GAC -3;P2:5’-AACGTCG ACCGCGTCGTCAAAAAGTTGGTG-3’。Towne感染 HFF细胞 96 h后,收集细胞用 Trizol提取总 RNA,采用一步法 RTPCR试剂盒 PCR扩增UL23基因的ORF序列,条件: 95℃预变性 5 min,95℃ 30s,54℃ 30 s,72℃ 1 min,30个循环,72℃10 min,4℃保存 10 min。下划线分别代表 EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点。PCR产物电泳后经胶回收试剂盒回收目的产物,进行 EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,使用纯化试剂盒纯化酶切产物,以EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切载体 pcDNA3.1(+),胶回收大片段,将 FLAG标签序列、UL23PCR片段、酶切后的pcDNA3.1(+)3种片段再经 T4 DNA连接酶在16℃连接,16-30 h后将得到的连接液,转化入DH5α感受态中,pcDNA3.1(+)-FLAG-UL23转化子经 PCR鉴定、酶切鉴定成功后,将此送往华大基因科技有限公司测序。

2.3 构建真核表达载体 pcDNA3.1(-)-UL23-HA HA标签序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列为:5’-GATCC T ACCCATACG ATGTTCCAG ATTACGCTTGG-3’,互补链 5’-TCGACCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAG-3,下划线为 SalⅠ、BamHⅠ黏性末端,使用前应退火。UL23构建方法同 2.2操作,使用纯化试剂盒纯化酶切产物 UL23片段;pcDNA3.1(-)载体使用 EcoRⅠ和 B amHⅠ双酶切,使用纯化试剂盒回收目的产物 pcDNA3.1(-)。将 HA标签序列、回收UL23片段、酶切后的 pcDNA3.1(-)载体三者再经 T4 DNA连接酶在 16℃连接,16-30 h后将得到的连接液转化入DH5α感受态中,pcDNA3.1(-)-UL23-HA转化子经 PCR鉴定、酶切鉴定成功后,将此送往华大基因科技有限公司测序。

2.4 构建 pcDNA3.1(+)-IGFBP4-FLAG 使用人工合成的 FLAG片段 (见方法 2.2),pGEX-4T1 -IGFBP4用 EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,胶回收 IGFBP4片段,以 EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切载体 pcDNA3.1(+),胶回收大片段,将 FLAG片段、IGFBP4片段、双酶切载体pcDNA3.1(+)3种片段再经 T4DNA连接酶在16℃连接,16-30h后将得到的连接液,转化入DH5ɑ感受态中,pcDNA3.1(+)-IGFBP4-FLAG转化子经 PCR鉴定、酶切鉴定成功后,将此送往华大基因科技有限公司测序。

2.5 COS-7细胞培养与转染 培养 COS-7细胞于6孔板中,3 mL 10%FBS的DMEM完全培养基(1 ×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素)置于 37℃、5%CO2培养箱中培养至密度达到 80%-90%时,转染重组质粒。转染方法按照 polyfect transfection reagent说明书。转染 48 h后,每孔加入 R IPA弱裂解液150μL,1 mmol/LP MSF,冰上裂解细胞 10 min,使用细胞刮刮下细胞,转移到一个预冷的 EP管,4℃、10 000 r/min离心 10 min,收集上清,准备做 GST-pull down和免疫共沉淀实验。

2.6 GST-pull down实验 将 pGEX-4T1、pGEX -4T1-IGFBP4分别转化大肠杆菌 BL21,用0.8 mmol/L IPTG 37℃诱导表达 4 h,10 000×g离心 5 min、弃废液,收集菌体,使用 binding/wash buffer [2 mmol/L KH2PO4,4.2 mmol/L Na2HPO4,10 mmol/L KCl,140 mmol/L NaCl,1%Triton X-100(V/V), 1 mmol/L P MSF]重悬并进行超声破碎,10 000 r/min, 4℃离心 20 min,取上清,各加入 20μL glutathione-Sepharose beads(谷胱甘肽琼脂糖珠),混匀,摇床上4℃孵育 30 min,用 binding/wash buffer洗涤 3次,每次 4℃离心 5 min。培养 COS-7细胞,pcDNA3.1 (-)-UL23-HA转染 COS-7细胞,收集裂解细胞上清,加入纯化好的蛋白,4℃孵育 3 h,2 000 r/min离心 5 min,收集琼脂糖珠,用 binding/wash buffer洗涤 3次,然后加 4×SDS上样缓冲液,沸水煮 5 min,取20μL进行 SDS-PAGE胶电泳,用半干法转印到PVDF膜上,在含 5%脱脂牛奶的 PBST封闭液中室温封闭 1 h,Ⅰ抗为 FLAG抗体,Ⅱ抗为 HRP标记的羊抗兔 IgG抗体,4℃振荡 50 min后,用 PBST漂洗4次,每次 15 min,而后加底物 ECL并于暗房进行 X光胶片的显影、定影。

2.7 免疫共沉淀实验 按照如上的方法将 pcDNA3.1(-)-UL23-HA、pcDNA3.1(+)-IGFBP4 -FLAG转入 COS-7细胞,分单转和共转。细胞裂解上清加入兔抗 FLAG多克隆抗体,4℃孵育 12 h,分别加入 protein G Plus/protein A agarose suspension各 20μL,混匀,摇床上 4℃孵育 3 h,2 000 r/min 4℃离心5 min,去上清,用1%Triton X-100(V/V)细胞裂解缓冲液洗涤 5次。然后加 4×SDS上样缓冲液,沸水煮 5 min,取 20μL进行 SDS-PAGE胶电泳,用半干法转印到 PVDF膜上,在含 5%脱脂牛奶的 PBST封闭液中室温封闭 1 h,分别用 HA、FLAG为Ⅰ抗做免疫印迹检测。

结 果

1 GST-pull-down确认 pUL23与 IGFBP4之间的相互作用

我们在实验中采用 pUL23作为诱饵蛋白,从人胚肾筛选到 79个阳性克隆[17]。经过进一步鉴定以及将测序结果在 GenBank上进行序列比对,发现宿主蛋白 IGFBP4(insulin-like growth factor binding protein 4,NM_001552)能与 pUL23蛋白相互作用。为了确定 pUL23与 IGFBP4之间的是否具有物理性相互作用,采用 GST-pull-down实验进行验证。重组质粒测序结果明,pcDNA3.1(+)-UL23-FLAG、pGEX-4T1-IGFBP4重组质粒构建成功。在大肠杆菌中用 IPTG分别诱导表达 GST和 GST-IGFBP4,并通过谷胱甘肽琼脂糖珠纯化,结果如图 1A所示,GST蛋白 (28 kD,图 1A)及 GST-IGFBP4 (53kD,图 1A)纯化效果很好。将纯化好的 GST、GST-IGFBP4融合蛋白分别与在 COS7细胞中表达的UL23-FLAG蛋白上清混合、冰上孵育 3 h,然后2 000 r/min离心 5 min,收集琼脂糖珠,最后用 FLAG抗体检测做免疫印迹检测。在 COS7细胞裂解液上清(图1B)与 GST-IGFBP4+UL23-FLAG(图1B)泳道中能检测出 UL23-FLAG,而在 GST+UL23-FLAG(图 1B)的泳道中不能检测出 FLAG-UL23,以上实验结果表明,pUL23在体外与 IGFBP4具有物理性相互作用。

2 免疫共沉淀验证 pUL23与 IGFBP4之间的相互作用

重组质粒 pcDNA3.1(-)-UL23-HA、pcDNA3.1(+)-IGFBP4-FLAG经测序证实构建成功。为了验证pUL23与 IGFBP4在细胞内的相互作用,进行免疫共沉淀验证实验。将 pcDNA3.1(-)-UL23 -HA、pcDNA3.1(+)-IGFBP4-FLAG转入 COS-7细胞,细胞裂解上清加入 protein G Plus/protein A agarose suspension,冰上孵育,离心沉淀,最后分别用HA、FLAG抗体做免疫印迹检测。结果表明,IGFBP4在细胞内能与 pUL23相互作用,见图 2。

Figure 1.The interaction of IGFBP4 and pUL23 by GST-pulldown assay.A:the purification of the GST fusion proteins.Lane 1:purified GST protein;Lane 2:purified GST-IGFBP4 protein;M:protein marker;B:Western blotting detection ofpUL23-HA in proteins that binds to GST-IGFBP4.图 1 GST-pull-down验证 IGFBP4和 pUL23具有物理性相互作用

Figure 2.Co-IP analysis for the interaction between pUL23 and IGFBP4.图 2 免疫共沉淀验证 pUL23和 IGFBP4具有相互作用

讨 论

UL23属 HCMVUS22基因家族成员,这个基因家族包含 12个成员,分别是 UL23、UL24、UL28、 UL29、UL36、UL4、TRSI、IRSI、US22、US23、US24、US26。这个基因家族成员的功能各不相同,如pUL36通过抑制 caspase-8诱导的细胞凋亡来促进病毒与细胞的共生作用[18];有的成员具有基因调控功能,象 HCMV的 pTRSI和 p I RSI与 pUL69协同作用HCMV主要 IE启动子,提高转录效率等。Adir等[16]研究认为 pUL23作为一个 tegument蛋白,可能与早期感染有关,不太可能在病毒装配中扮演一个关键角色。因为在细胞质中,pUL23可能与细胞蛋白相互作用,作为胞内信号途径参与基因调节,或者影响翻译与转录的稳定性,换句话说,通过与细胞蛋白的作用,可能会控制或抑制胞内蛋白参与的抗病毒机制。

我们通过酵母双杂交技术从人胚肾 cDNA文库筛选到到一个与 pUL23相互作用的蛋白 -IGFBP4。IGFBP4是人胰岛素样生长因子结合蛋白 4,是 IGFBPs家族中最小的分子,为细胞增殖抑制因子。一种可以与胰岛素样生长因子 (IGFs,IGF1/IGF2)结合的分泌性蛋白,通过 IGFs调节细胞的生长、分化、凋亡、黏附和运动[19]。IGFBP-4与 IGFs结合可以调节 IGFs与 IGF-I型受体间的相互作用,影响下游的PI3K、MAPK和 PKC信号转导途径,改变其促有丝分裂效应、凋亡抑制效应和促细胞运动作用,达到抑制细胞生长的目的[20,21]。通过 GST-pull-down、免疫共沉淀技术表明:pUL23蛋白在胞内可以与 IGFBP4相结合。由于 IGFBP4是分泌蛋白,pUL23与 IGFBP4相互作用有可能将其滞留在细胞质中,不让其分泌到胞外,使 IGFBP4不能与 IGF-I型受体相互作用,也有可能是 pUL23与 IGF1/IGF2竞争结合IGFBP4,从而影响 IGFBP4发挥抑制细胞增殖的功能。因此,我们推测当 HCMV感染细胞后,病毒pUL23蛋白与宿主蛋白 IGFBP4的相互作用,可能会影响 IGFBP4调节细胞生长的过程,从而调控病毒的生长过程。pUL23蛋白与宿主蛋白 IGFBP4相互作用的研究为进一步阐述 pUL23调控病毒生长分子机制奠定了坚实基础。

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