G蛋白在快速老化痴呆小鼠SAMP8脑组织中的表达*

2010-03-13 03:28阚伯红张海霞于建春韩景献
天津医药 2010年11期
关键词:月龄皮质海马

阚伯红 张海霞 于建春 韩景献

G蛋白是位于细胞膜上重要的信号转导蛋白,可被膜受体G蛋白结合受体(GPCR)激活,传递多种膜外信号进入膜内。Gαq/11可激活磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C,而GαS和Gαi/o参与腺苷酸环化酶的激活和抑制。越来越多的研究表明在阿尔茨海默病(AD)中存在G蛋白信号转导的异常[1-3]。本研究利用Western-blot方法分别检测快速老化痴呆小鼠SAMP8和相应月龄的正常老化小鼠SAMR1中Gαq/11、Gαi和GαS蛋白的表达情况,为AD的发病研究和治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 甘氨酸、Tris碱、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺等购自BBI公司,SDS和BCA蛋白检测试剂盒购自上海生工生物工程有限公司,蔗糖购自北京普博欣生物公司,脱脂奶粉购自BD公司,磷酸二氢钠、甲醇和氯化钠等购自天津市化学试剂公司,Tween-20购自北京鼎国公司,兔多克隆抗体Gαs、兔多克隆抗体Gαi、PVDF膜和ECL发光试剂盒购自美国Millipore公司,兔多克隆抗体Gαq/11购自美国Santa Cruze公司,亲和纯化山羊抗兔IgG购自美国KPL公司,浆膜蛋白提取试剂盒购自BioVision公司(Catalog#K268-50)。

1.1.2 主要仪器 DYY-11型电泳仪、DYCA-24D双垂直板电泳槽购自北京市六一仪器厂,高能小型转膜仪、UNIVERSAL 16R高速台式冷冻离心机均购自美国GE公司,TS-1型脱色摇床购自江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司,Quantity one凝胶成像系统购自BIO-RAD公司,AL104型电子天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,酶标仪购自日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及饲养方法 所取雄性小鼠均由天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供,均为二级实验动物。所有实验动物都在完全一致的生活环境和饮食条件下饲养,进食方式为自由进食,在特制的鼠笼,每笼5只小鼠,每周更换鼠笼一次,室温为(22±2)℃,以排除饮食及环境等所有可能对实验动物基因表达产生影响的因素。选取8月龄雄性SAMP8 5只,8月龄雄性SAMR1 5只,另取18月龄雄性SAMP8 5只,18月龄雄性SAMR1 5只,以SAMR1作为正常对照组。

1.2.2 浆膜蛋白的制备 脱臼处死后迅速取出海马和大脑皮质组织,用预冷的生理盐水洗去血渍,称质量后完全按试剂说明书制备浆膜蛋白。-70℃保存。

1.2.3 Western-blot方法测定G蛋白表达水平 将浆膜蛋白溶解于适量的PBS(含0.5%Triton X-100)缓冲液,以BCA法测定蛋白浓度,以上述缓冲液将蛋白浓度调成一致,加入5×上样缓冲液。100℃变性5 min,瞬时离心。用10%的聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,用Amersham公司生产的彩虹预染Marker作为分子质量依据,样品每孔上样量40 μg,上8板胶,其中2板用于染色确定上样量的一致性,另6板用电转移的方法转移到PVDF膜上。沿分子质量标记将膜剪成上下两部分,5%脱脂奶粉室温封闭1 h后,分别与Gαq/11(1∶1 000)、Gαi(1∶2 000)和Gαs(1∶1 000)抗体4℃过夜。以TBST洗去未结合的抗体后,将膜与辣根过氧化物酶标记的IgG(1∶2 000)抗体室温作用2 h。TBST充分洗涤后,用增强型ECL试剂盒显影1 min,置于凝胶成像系统下拍照。

1.2.4 Western-blot的结果分析和质量控制 对拍照结果进行分析,结果用相对表达量表示。质量控制时,根据分析同时电泳副本胶的影像来校准上样量的偏差,同一板胶同时上对照组和实验组的样品排除不同批次在条件不同时造成的影响。

1.3 统计学处理 实验数据使用SPSS 16.0统计软件处理,数据采用均数±标准差(±s)表示,两组之间比较,采用两样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gαq/11、Gαi和Gαs蛋白在8月龄小鼠中的表达 与同月龄SAMR1相比,SAMP8皮质和海马中Gαq/11、Gαi和Gαs蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2 Gαq/11、Gαi和Gαs蛋白在18月龄小鼠中的表达 小鼠SAMP8皮质和海马中Gαq/11的表达量均低于同月龄对照小鼠SAMR1的表达量(P<0.05),而Gαi的表达量只在海马中明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表1 月龄小鼠2组间皮质、海马中蛋白的相对表达量 (n=5,±s)

表1 月龄小鼠2组间皮质、海马中蛋白的相对表达量 (n=5,±s)

均P>0.05

皮质 海马组别SAMR1 SAMP8 t Gαq/11 9.81±2.35 10.19±2.66 0.24 Gαi 11.70±4.50 8.30±1.37 1.62 Gαs 10.21±2.16 9.79±1.26 0.38 Gαq/11 11.01±6.91 8.99±4.89 0.53 Gαi 11.20±5.03 8.80±3.06 0.91 Gαs 11.06±4.17 8.94±3.79 0.83

表2 18月龄小鼠2组间皮质、海马中蛋白的相对表达量 (n=5,±s)

表2 18月龄小鼠2组间皮质、海马中蛋白的相对表达量 (n=5,±s)

*P<0.05

皮质 海马组别SAMR1 SAMP8 t Gαq/11 10.05±2.24 6.62±1.88 2.87*Gαi 9.83±3.91 6.83±2.42 1.15 Gαs 9.28±2.40 7.39±1.58 1.62 Gαq/11 9.40±0.62 7.27±1.73 2.84*Gαi 10.58±2.61 6.08±2.34 3.15*Gαs 9.27±2.16 7.40±2.58 1.36

3 讨论

既往大多数研究者普遍采用AD患者死后尸检脑组织作为研究对象,并分别选取脑组织的不同部位对Gαq/11、Gαi和Gαs等的表达量和活性进行研究,但是由于尸检组织来源有限,标本不新鲜和死因各异等缺陷,致使所得结果存在很大差异[4]。

而本研究采用SAMP8小鼠为研究对象,克服了上述研究的缺陷。SAMP8是一种自然发病、伴快速老化的AD模型鼠,它与人类衰老和痴呆的临床特征比较接近,是一种较好的研究AD早期病理生理改变的动物模型[5]。在笔者前期的研究中,SAMP8在8月龄即出现了空间学习和记忆障碍,并随增龄而病情加重[6]。本研究分别选取8月龄和18月龄SAMP8来研究AD发病早期和晚期时Gαq/11、Gαi和Gαs的表达量变化,结果表明,SAMP8在8月龄时皮质和海马中Gαq/11、Gαi和Gαs的表达量并未发生明显变化,这与AD早期体内对G蛋白信号的精细调节有关,使其不至于严重影响G蛋白下游信号分子和产物。小鼠SAMP8的平均寿命为16个月,到18个月时,小鼠SAMP8的各种生理功能都已进入终末阶段。相对于同月龄正常对照SAMR1,SAMP8在18月龄时,皮质中的Gαq/11出现减低,海马中的Gαi和Gαq/11均降低,而Gαs均无明显变化。此结果部分与过去研究AD死后患者所得结果一致[7]。同时,在AD晚期,相对于皮质而言,海马中Gαi和Gαq/11的表达量均出现明显减低,这与海马是学习记忆形成的关键部位、对外界损伤最敏感的部位有关。与腺苷酸环化酶途径相比,AD中磷脂酰肌醇途径受到的损伤相对更广泛,最终通过PKC缺陷导致AD的发生[8]。笔者今后将进一步测定Gαq/11和Gαi下游信号分子的表达和活性,以期为AD的治疗提供准确的作用靶点。

[1] Kim JH,Kim HJ.Direct involvement of G protein q/11 subunit in regulation of muscarinic receptor-mediated sAPP release[J].Arch Pharm Res,2005,28(11):1275-1281.

[2] Cowburn RF,O’Neill C,Bonkale WL,et al.Receptor-G-protein signalling in Alzheimer’s disease[J].Biochem Soc Symp,2001(67):163-175.

[3] Hashimoto E,Ozawa H,Saito T,et al.Impairment of Gsα function in mal aging[J].J Neural Transm,2004,111(3):311-322.

[4] González-Maeso J,Torre I,Rodríguez-Puertas R,et al.Effects of age,postmortem delay and storage time on receptor-mediated activation of G-proteins in human brain[J].Neuropsychopharmacology. 2002,26(4):468-78.

[5] Pallas M,Camins A,Smith MA,et al.From aging to aAlzheimer’s disease:unveiling “the switch”with the senescence-accelerated mouse model(SAMP8)[J].J Alzheimer’s Dis,2008,15(4):615-624.

[6]褚芹.SAMP8行为学、海马比较蛋白质组学的增龄变化及针刺干预作用的研究[D].天津:天津中医药大学.2006.

[7] García-Jiménez A,Fastbom J,Ohm TG,et al.G-protein alpha-subunit levels in hippocampus and entorhinal cortex of brains staged for Alzheimer’s disease neurofibrillary and amyloid pathologies[J]. Neuroreport,2003,14(11):1523-1527.

[8] Alkon DL,Sun MK,Nelson TJ.PKC signaling deficits:a mechanistic hypothesis for the origins of Alzheimer's disease [J].Trends Pharmacol Sci,2007,28(2):51-60.

猜你喜欢
月龄皮质海马
海马
人参-黄芪与熟地-山茱萸影响肾上腺皮质瘤细胞皮质酮生成的比较研究
皮质褶皱
迎秋
湖州33月龄男童不慎9楼坠落上海九院对接“空中120”成功救治
海马
提高育肥猪出栏率合理的饲养密度
不同月龄荷斯坦牛产奶量的研究
“海马”自述
颈动脉狭窄伴局限性皮质脑萎缩22例临床观察