过氧乙酸复方消毒剂杀灭枯草杆菌芽孢的实验研究

曾宏逵,谭伟龙,钱万红,朱元元,季 昶,曹根宝

过氧乙酸是一种高效消毒剂,对各种微生物均有较强的杀菌效果[1],但因其较强的腐蚀性,实际应用中多使用其复方,以降低过氧乙酸的使用浓度并确保其杀菌效果[2]。为应对突发公共卫生事件应急洗消的需要,我们研制了含过氧乙酸、二氯二甲基海因和其他助剂等成分的复方消毒剂,在实验室和模拟现场探讨了其对枯草杆菌芽孢的杀菌效果,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 过氧乙酸为市售,有效含量为15%～17%,二氯二甲基海因由某消毒剂厂提供,取上述两种消毒剂按不同有效含量混配配成A、B、C、D四种复方。试验菌为枯草杆菌黑色变种芽孢(ATCC 9372,由军事医学科学院提供)。不锈钢载体(直径12 mm、厚0.5 mm)、模拟现场试验用不锈钢钢管(围绕钢管口锯凹槽数条),经脱脂处理,压力蒸汽灭菌后,烤干备用。枯草杆菌黑色变种芽孢(以下简称枯草杆菌芽孢)的制备:将菌种分别接种于普通肉汤培养基管内,放入37℃恒温箱中培养24 h。吸取肉汤培养物4 ～5 m l转种于罗氏瓶普通琼脂培养基上,37℃培养6 d。当镜检发现芽孢形成率超过95%时,每个罗氏瓶用10 ml0.03 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗下芽孢,以无菌纱布过滤于三角烧瓶内。将三角烧瓶置45℃水浴箱中24 h进行芽孢断链。用PBS冲洗芽孢悬液(3000×g离心,每次30 min)2次。将经洗涤的芽孢悬液放入60 ℃水浴箱中30 min,以杀灭细菌繁殖体,将芽孢液计数后放入4℃冰箱备用。菌悬液和菌片的制备:试验前,用含10 g/L胰蛋白胨的TPS培养基制成菌悬液,吸取部分菌悬液制作菌片,部分菌悬液与有机干扰物1∶1混匀备用[3]。

1.2 实验方法

1.2.1 中和剂选择试验 试验分为6组,以枯草杆菌芽孢为代表菌,按悬液定量杀菌试验程序进行[3-4]。

1.2.2 悬液定量杀菌实验[4-5]按每试管4 ml消毒液(阳性对照为TPS)于(20±1)℃水浴中平衡温度10 min,加入1 ml菌悬液,作用至预定时间,吸取0.5 ml菌、药混悬液加入4.5 ml中和剂中,混匀,中和10 min。混匀后吸取1ml样液接种平皿,倾注琼脂,将平板置37℃恒温箱培养,72 h后观察结果,计数菌落数并计算杀灭对数值。

KL=lgN1-lgNt(KL:杀灭对数值;N1:对照组平均活菌浓度;Nt:实验组活菌浓度)

1.2.3 载体定性杀菌实验 在无菌平皿里按每片菌片5.0 ml的量加入消毒液(阳性对照为硬水)于(20±1)℃水浴中平衡温度5 min,用无菌镊子分别放入预先制备的菌片,并使之浸透于消毒液中,作用至预定时间,用无菌镊分别将菌片移入一含5.0 ml中和剂肉汤试管中,置37℃恒温箱培养,7 d后观察结果。实验组无菌生长,阳性对照组正常生长,判定为灭菌合格。

1.2.4 模拟现场消毒实验 按每件载体10.0 ml的量加入消毒液(阳性对照为硬水)于(20±1)℃水浴中平衡温度5 min,将40 个端部染有枯草杆菌芽孢悬液的不锈钢钢管分别浸没于消毒液中,每个复配液试验10个样本,作用至预定时间,用无菌镊将不锈钢钢管放于盛有10.0 ml中和剂溶液的小烧杯中,中和10 min,混匀(必要时用TPS稀释)后,吸取1ml样液接种平皿,倾注普通营养琼脂,将平板置37℃恒温箱培养,72 h后观察结果,计数菌落数并计算杀灭对数值。

1.2.5 消毒效果的评价 参照国家卫生部《消毒技术规范》中的相关规定进行评价。

2 结 果

2.1 中和剂选择试验结果 根据“中和剂选择试验”判别标准:试验结果按第1组不长菌或菌落数远少于第2组;第2组菌落数较第1组多,但较第3、4、5组少;第3、4、5组组间菌落数相差≤15.0%;第6组无菌生长时,所选中和剂及其浓度适宜。本试验中用含10 g/L硫代硫酸钠和0.5%吐温-80 的TPS溶液可有效中和含量为500 mg/L有效氯溶液和1000 mg/L过氧乙酸的残余作用,中和剂及中和产物对受试菌及培养基无影响,结果为3次试验平均值(表1)。

表1 过氧乙酸复方消毒剂的中和剂选择试验结果

2.2 悬液定量杀菌实验效果 不同浓度过氧乙酸复方消毒剂在25℃条件下,对枯草杆菌芽孢进行杀灭试验。当有效氯与过氧乙酸的含量分别为300 mg/L与100 mg/L、100 mg/L与500 mg/L时,作用15 min,对芽孢的杀灭对数值均为4.00;当含量分别为300 mg/L和500 mg/L作用15 min,杀灭对数值达7.75;当含量分别为500 mg/L和1000 mg/L作用10 min,杀灭对数值即达7.74(表2)。

表2 过氧乙酸复方消毒剂对枯草杆菌芽孢杀灭结果

2.3 载体定性杀菌实验效果 经5次实验结果证明,以500 mg/L有效氯与1000 mg/L过氧乙酸组合及300 mg/L有效氯与500 mg/L过氧乙酸组合,对载体上枯草杆菌芽孢分别作用15、30、45 min,各次实验的肉汤管均无菌生长,阳性对照肉汤管10支全部有菌生长,阳性对照组平均回收菌落数5.4×106CFU/片,阴性对照无菌生长。

2.4 模拟现场杀菌实验结果 四种复方消毒剂对枯草杆菌芽孢分别作用10 min,杀灭对数值均达3.5以上,以有效氯与过氧乙酸的含量分别为500 mg/L和1000 mg/L时作用10 min,杀灭对数值达4.20 ～6.40(表3)。

表3 过氧乙酸复方消毒剂杀灭枯草杆菌芽孢的模拟现场实验结果

3 讨 论

近年来,随着新发传染病的不断出现,部分旧的传染病重新肆虐,特别是一些不明原因的传染性疾病的出现,给疫源地现场消毒处置工作带来了不少的麻烦[5-6]。高效消毒剂大多具有较强的腐蚀性,降低浓度来减轻腐蚀性又恐达不到消毒效果,因此本研究的目的就是要配制一种具有高效消毒效果的复方消毒剂,用于不明原因感染性疾病的疫源地消毒处置和被污染装备的表面消毒。

实验结果表明,在室温下,含二氯二甲基海因及过氧乙酸的复方消毒液,对悬液中的枯草杆菌黑色变种芽孢均有较好的杀灭效果。含有500 mg/L有效氯与1000 mg/L过氧乙酸的A组复方消毒剂悬液杀菌时10 min的杀灭对数值达7.74,载体定性杀菌时15 min杀灭率达100%,模拟现场实验时,作用10 min杀灭对数值达4.20 ～6.40,达到了高效消毒效果。

由于过氧乙酸的稳定性普遍较差,二元制剂虽有良好的稳定性,但使用前需合成24 ～48 h,不适合应急条件下使用,且合成后的浓度和稳定性也欠理想,难以实现用作较长时间的贮备[7-8],因此下一步研究中,要解决好该复方消毒剂储存过程中的稳定性和有机物对杀菌效果影响的问题[9]。

[1] 姚楚水,王长德,杨 燕,等.过氧乙酸杀灭微生物效果的试验观察[J].中国消毒学杂志,2003,20(4):254-255.

[2] 钱万红,王忠灿,吴光华.消毒杀虫灭鼠技术[M].北京:人民卫生出版社,2008:107-113.

[3] 沈建忠,赵国良,李茂全,等.过氧乙酸复方消毒剂杀菌效果及腐蚀性试验观察[J].中国消毒学杂志,2001,18(1):11-14.

[4] 邱洪流,谢 琴,谢 帆.两种碘伏消毒液杀菌效果比较研究[J].中国消毒学杂志,2006,23(6):555-556.

[5] 汪茂荣.恙虫病的流行病学与诊治进展[J].东南国防医药,2009,11(6):526-529.

[6] 刘士军.做好大型军事演习部队卫生防疫保障的几点体会[J].东南国防医药,2009,11(3):285-286.

[7] 张志成,张晓玲,蒋丽娟,等.二元包装过氧乙酸杀菌效果和储存稳定性试验观察[J].中国消毒学杂志,2007,24(2):142-143.

[8] 谭伟龙,钱万红,沈建忠.过氧乙酸杀菌剂研究进展[J].医学动物防制,2008,9(9):641-643.

[9] 曾宏逵,谭伟龙.某部队医院消毒灭菌效果的动态监测与分析[J].东南国防医药,2009,11(4):172-175.