特异PCR方法对枯草芽孢杆菌群的鉴定区分

刘勇 李辉 李金霞 程池

枯草芽孢杆菌群（Bacillus subtilis group）是枯草芽孢杆菌及其近缘种的总称，其包括枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）和萎缩芽孢杆菌（B.atrophaeus）等。枯草芽孢杆菌群细菌能够产生多种代谢产物，在食品、医药、饲料和农业等领域中具有重要应用价值，因此对其准确鉴定具有重要理论和实践意义。

特异PCR技术（specific PCR）是当今快速准确鉴定菌种的方法之一，可避免培养方法和生化鉴定方法的烦琐，在临床诊断、食品检测和土壤微生物鉴定等领域广为应用。特异PCR技术不仅可以实现微生物种的区分，也可实现亚种间的区分，如Torriani（1999）等设计脯氨酸亚氨基肽酶基因特异引物，通过PCR产物大小成功对Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus和L.delbrueckii subsp.lactis两个亚种进行了区分。Oleg等（2004）和权春善等（2006）利用枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌yyaR、yyaO和tetB-tetL基因顺序的差异设计特异引物，通过特异PCR对二者进行区分。Idriss等（2002）则根据枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因差异，通过特异PCR完成了一些枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的区分。

β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC 3.2.1.78）是一种半纤维素水解酶，能够水解半纤维素主要组成成分甘露聚糖类多糖主链的1,4-β-甘露糖苷键。枯草芽孢杆菌群中的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌都能够产生β-甘露聚酶。本文根据枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌基因组中β-甘露聚糖酶基因(gmuG或ydhT)上下游序列，设计了3对种特异引物，并以中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC）保藏的33株枯草芽孢杆菌群细菌作为参考菌株，试图通过特异PCR方法对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌进行鉴定区分。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株33株均为中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）保藏菌种，其中枯草芽孢杆菌（B.subtilis）11 株，CICC 编号为 10020、10076、10077、10078、10088、9011、20522、10260、10261、10262、10263；地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）13 株，CICC 编号为 10084、10085、10086、10087、10101、10181、10182、10266、10332、10334、10335、10336、10340；解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）9株，CICC编号为20164、20604、20605、20606、20661、22383、23260、23281 和 23753。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP购自天为时代生物有限公司；溶菌酶购自Sigma公司，蛋白酶K购自Merk公司；其它化学药品均为进口分析纯产品。

1.3 培养基

营养肉汁培养基：蛋白胨5 g/l、牛肉膏3 g/l、氯化钠5 g/l，pH值7.0。固体培养基则添加琼脂15 g/l。

1.4 特异PCR引物的设计

通过分析 B.subtilis subsp.subtilis 168（AL009126）全基因组，B.licheniformis ATCC14580（CP000002）全基因组和 B.amyloliquefaciens FZB42（CP000560）全基因组，发现三种芽孢杆菌都只具有一种β-甘露聚糖酶基因。根据三种芽孢杆菌全基因组中β-甘露聚糖酶基因上下游序列设计了3对种特异性引物（见表1）。引物由上海生物工程技术有限公司合成。

表1 PCR引物

1.5 特异PCR

基因组DNA提取参考文献。以33株枯草芽孢杆菌群细菌DNA为模版，分别用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因特异引物进行PCR反应。PCR反应体系50 μl：DNA模版0.5 μl（约 10 ng）、10×Taq DNA 聚合酶 Buffer 5 μl、10 pmol/μl dNTP 1 μl、10 pmol/μl正反向引物各 1 μl、2.5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.5 μl、添加 ddH2O 至 50 μl。PCR 反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s；35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 特异PCR产物的测序

纯化PCR产物，用ABI3700测序仪测序。测序由北京宝杰罗生物技术有限公司完成。测序结果用DNASTAR软件参照正反序列图谱人工校对。

2 结果

以33株枯草芽孢杆菌群细菌DNA为模版，利用枯草芽孢杆菌特异引物 (Bsu-man-1F和Bsu-man-1R)进行PCR反应，结果如图1 A：11株枯草芽孢杆菌扩增出长约1300 bp的单一条带，与预期产物大小一致；而13株地衣芽孢杆菌和9株解淀粉芽孢杆菌及阴性对照（CK）无条带。以33株菌DNA为模版，利用地衣芽孢杆菌特异引物 (Bli-man-1F和Bli-man-1R)进行PCR反应，结果如图1 B：13株地衣芽孢杆菌扩增出长约1300 bp的单一条带，与预期大小一致；而11株枯草芽孢杆菌、9株解淀粉芽孢杆菌及阴性对照（CK）无条带。当以33株菌DNA为模版，利用解淀粉芽孢杆菌特异引物(Bam-man-1F和Bam-man-1R)进行PCR反应，结果如图1 C：9株菌出现长约1300 bp的单一条带，与预期产物大小一致；而11株枯草芽孢杆菌、13株地衣芽孢杆菌及阴性对照（CK）无条带。

PCR产物测序后登录GenBank，登录号为GQ859462-GQ859494。序列经Blast比对表明，11株枯草芽孢杆菌与模式株B.subtilis subsp.subtilis NCIB3610T（NZ-ABQL01000004）β-甘露聚糖酶基因相似性大于97%；13株地衣芽孢杆菌与模式株B.licheniformis ATCC14580T（CP000002）β-甘露聚糖酶基因相似性大于93%；9株解淀粉芽孢杆菌与模式株B.amyloliquefaciens CCTCC AB94022T(FJ589030)及B.amyloliquefaciens FZB42（CP000560）β-甘露聚糖酶基因相似性大于92%。PCR产物测序结果表明，特异引物对三种枯草芽孢杆菌群细菌β-甘露聚糖酶基因具有很好的种特异性。

3 讨论

特异PCR技术（specific PCR）具有简单、快速、准确的优点，其在菌种检测鉴定中具有重要应用价值。本文根据枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌基因组中β-甘露聚糖酶基因上下游序列设计三种细菌β-甘露聚糖酶基因种特异性引物（见表1），并通过特异PCR方法对三种枯草芽孢杆菌群细菌进行鉴定区分。实验结果表明（见图1），特异引物对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶基因具有很好的种特异性，能够有效区分这三种芽孢杆菌。该特异PCR方法无需测序，节约成本；而且较生理生化方法简便快捷。

β-甘露聚糖酶是一种新型饲料添加剂，其可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可消除豆类中甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕能量消化率。枯草芽孢杆菌群中的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌具有β-甘露聚糖酶基因，可以产生β-甘露聚糖酶。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌还可作为微生物制剂添加到饲料中，这与它们能够产生β-甘露聚糖酶等多种水解酶是密不可分的。为了饲料微生物制剂的安全性和有效性，对微生物制剂菌种的准确鉴定十分必要。因而，β-甘露聚糖酶基因特异PCR方法可以用于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌两种饲料微生物制剂菌种的鉴定区分，也可用于检测两种饲料微生物制剂菌种的β-甘露聚糖酶基因。

图1 PCR电泳

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