沙葱多糖对S180腹水瘤小鼠抗肿瘤和免疫作用的实验研究

扈瑞平 张兴夫 杜 玲 敖长金 巴德玛 邓 凤

沙葱(Allium mongolicum Regel)属被子植物门(Angiospermae)百合科(LiLiaceae)葱属(Allium)，学名蒙古韭（包颖，2000），是蒙古族传统的野生食用植物，也是内蒙古草原生长量大且为牲畜喜食的牧草。沙葱营养丰富，地上部分可入蒙药，据蒙药典记载，沙葱具有降血压、降血脂、开胃消食、健肾壮阳、治便秘等特殊功效，被誉为“菜中灵芝”（燕玲，1999）。研究表明，沙葱能显著提高动物的免疫能力，但由于沙葱中含有多种有效成分,起免疫作用的究竟为何种成分及其免疫作用机理尚不清楚。近年来，植物活性多糖的研究备受关注。许多研究表明，多糖具有促进机体免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗炎、降低血脂以及改善动物生产性能等一系列作用，但其主要作用表现为抗肿瘤和免疫调节（陈芝芸，2003）。实验证明，饲料中添加活性多糖能显著提高畜禽免疫功能，促进免疫器官发育，抗体生成，激活淋巴细胞，促进动物生长，降低动物死亡率,因此，植物活性多糖是一种很有前途的可以替代抗生素的天然绿色饲料添加剂。我们充分利用植物资源沙葱，对其活性成分多糖进行分离并研究对S180腹水瘤小鼠肿瘤的抑制作用和对免疫器官、免疫细胞分泌细胞因子的影响，以初步探讨沙葱多糖的抗肿瘤和免疫调节作用及其机制，为开发新型、高效、安全的饲料添加剂或药物提供科学依据。

1 试验材料

1.1 试验材料

鲜沙葱采自于内蒙古鄂尔多斯鄂托克旗天然草场。

1.2 试验动物与瘤株

健康昆明种小鼠，体重（20±2）g，雌雄各半，由内蒙古大学实验动物中心提供，分笼饲养，自由饮水，饲喂标准颗粒饲料。小鼠S180细胞瘤株购自中科院上海细胞库。

1.3 主要试剂与仪器

环磷酰胺（CTX，江苏恒瑞医药股份有限责任公司生产，批号 20080902），小鼠 IL－2、TNF－α 测定试剂盒(ADL公司生产)，其它试剂均为分析纯；电子天平(上海精仪公司生产，型号FA1004N)、低温冷冻干燥机(北京博医康公司生产，型号 FD－1A－50)、高速冷冻离心机(美国杜邦公司生产，型号ST－21)、连续波长酶标仪(Bio－RAD 公司生产，型号 Bench－markPlusTM)、CO2培养箱(Thermo公司生产，型号5410)。

2 试验方法

2.1 沙葱多糖的制备

将烘干后的沙葱用98%的工业酒精按1：8(烘干沙葱： 酒精)的比例70℃脱脂1次，65℃烘干后按25：1的水料比80℃浸提8 h，抽滤弃去残渣后的多糖提取液经旋转蒸发仪浓缩到原体积的1/3，经8%的三氯乙酸除蛋白1次，离心除去蛋白沉淀，上清液加等体积无水乙醇于4℃过夜，7800×g离心30 min得沙葱多糖，采用苯酚－硫酸法测定多糖含量为87.23%，冷冻干燥后称重备用。实验前用生理盐水配置成沙葱多糖高剂量组（6.25 mg/ml）溶液，中、低剂量组按比例稀释。

2.2 造模方法

抽取已接种7～8 d S180腹水瘤小鼠的腹水与生理盐水按1：2的比例进行稀释,台盼蓝染色后进行活细胞计数,活细胞率＞95%，稀释细胞悬液使活细胞数达到（2～4）×107个/ml，无菌条件下,按常规每只鼠腹腔接种0.2 ml细胞悬液,制成腹水瘤模型（李巧兰，2007）。

2.3 试验动物分组及给药

于接种当天将小鼠随机分为2大组（标记为A、B组）。

A组为观察组，共50只，每组10只。分别标记为模型组、CTX组（20 mg/ml）、沙葱多糖高剂量组（6.25 mg/ml）、沙葱多糖中剂量组（0.625 mg/ml）、沙葱多糖低剂量组（0.0625 mg/ml）。

B组为屠宰组，共60只，每组10只。分别标记为正常对照组、模型组、CTX组、沙葱多糖高剂量组、沙葱多糖中剂量组、沙葱多糖低剂量组。

沙葱多糖高、中、低剂量组于接种8 h后开始灌胃给药治疗，每天早晚各1次，每次1 ml。CTX组于接种当天皮下肌肉注射治疗环磷酰胺，给药量为0.15ml/只小鼠，每4 d给药1次。模型组和正常对照组不给予药物治疗。

2.4 小鼠生存质量、腹水形成和生存时间观察

每天定时称量A组小鼠的体重(g)和腹围(cm),同时观察小鼠腹水的形成、饮食活动、精神状况，记录死亡时间，计算体重比、腹围比和生命延长率（李巧兰，2007）。

生命延长率（%）=（试验组生存天数－对照组生存天数）/对照组生存天数×100。

2.5 小鼠免疫脏器指数的测定

B组小鼠于试验7 d后，即第8 d早晨称重后摘眼球取血 0.5～1 ml，3000 r/min离心5 min制备血清，－20℃保存后用于TNF－α和IL－2的含量测定，然后脱颈椎处死小鼠,分离胸腺、脾脏，并称取其湿重，按下列公式计算胸腺指数和脾脏指数（沈关心，2002）。

免疫器官指数（mg/10 g）=小鼠免疫器官重量（mg）/小鼠屠体重(10 g)。

2.6 小鼠血清IL－2和TNF－α的测定

取50 μl/孔血清,每样均设3个复孔，测定采用双抗体夹心ABC－ELISA法，操作步骤严格按照小鼠血清TNF－α和IL－2定量ELISA试剂盒使用说明书进行。

2.7 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件中的单因素方差分析(One－wayANOVA)对实验数据进行统计分析,结果以均数±标准偏差（X±s）表示，检验水平 а=0.05,以 P＜0.05为差异显著,P＜0.01为差异极显著。

3 结果与分析

3.1 沙葱多糖对S180腹水瘤小鼠体重、腹围和存活期的影响

模型组小鼠从接种第3 d起腹部便开始增大，至5 d左右腹部增大明显，多糖治疗组从接种第5 d起腹部才开始逐渐增大，且腹围增加不显著；与模型组相比，沙葱多糖组小鼠在治疗过程中活动、饮食及精神状况良好，较晚（约8～9 d）出现贫血症状；CTX组小鼠厌食、脱毛、活动减少、精神状况不佳，腹水较少或无腹水产生，结果见表1。

表1 沙葱多糖对S180腹水瘤小鼠体重、腹围和生存期的影响（X±s）

与模型组相比，CTX组和多糖治疗组均能延长小鼠的存活期。除沙葱多糖低剂量组外，S180腹水瘤小鼠经治疗后生命延长率均超过“抗癌药体内药效试验规程”限定的30%的标准（肖洪彬，2007）。沙葱多糖低剂量组小鼠的存活期与模型组相比差异不显著（P＞0.05），其它各组小鼠的存活期与模型组相比均有显著或极显著性差异（P＜0.05、P＜0.01），其中以沙葱多糖高剂量组作用效果最为明显（P＜0.01），且多糖治疗组对小鼠存活期的影响表现出在一定浓度范围内的剂量依赖关系。

3.2 沙葱多糖对小鼠胸腺和脾脏指数的影响（见表2）

表2 沙葱多糖对小鼠免疫器官指数的影响（X±s）

由表2可见，与模型组相比，CTX组对S180腹水瘤小鼠胸腺、脾脏指数的影响不显著（P＞0.05），不同剂量沙葱多糖组均能显著或极显著提高S180腹水瘤小鼠的胸腺、脾脏指数（P＜0.05、P＜0.01）；与正常对照组相比，CTX组小鼠的胸腺、脾脏指数均明显降低，且有显著性差异（P＜0.05），沙葱多糖高剂量组促进S180腹水瘤小鼠胸腺、脾脏指数增长的效果最为明显，且差异极显著（P＜0.01）。

3.3 沙葱多糖对S180腹水瘤小鼠血清IL－2和TNF－α的影响（见表3）

表3 沙葱多糖对S180腹水瘤小鼠血清IL－2和TNF－α 水平的影响（X±s）

表3结果表明：模型组小鼠血清的IL－2和TNF－α水平均较正常对照组下降，但差异不显著（P＞0.05），CTX组与正常对照组和模型组相比，小鼠血清中IL－2的含量明显下降，且有显著性差异（P＜0.05），小鼠血清TNF－α的水平也有所降低，但差异均不显著（P＞0.05）。这说明模型组小鼠由于患腹水瘤，其细胞免疫功能有所下降，环磷酰胺虽可以抑制肿瘤的发生发展，但同时会引起机体免疫抑制，这与李洁关于半枝莲对S180肿瘤小鼠抑瘤作用中的研究结果相符（李洁，2008）。

经不同剂量沙葱多糖治疗后的S180腹水瘤小鼠血清IL－2和TNF－α水平上升，与模型组比较，均有显著性差异（P＜0.05、P＜0.01）；与正常对照组相比较，除沙葱多糖低剂量组对血清IL－2的含量影响无显著差异外（P＞0.05），其余各多糖组均能显著提高S180腹水瘤小鼠血清 IL－2和 TNF－α 的含量（P＜0.05、P＜0.01），以沙葱多糖高剂量组促进S180腹水瘤小鼠免疫细胞分泌同时两种细胞因子的效果最为明显（P＜0.01），另外，不同剂量沙葱多糖组与模型组、正常对照组相比，小鼠血清TNF－α的含量均有极显著差异（P＜0.01）。

4 讨论

在实验过程中发现,沙葱多糖组S180腹水瘤小鼠的生活状况明显好于与模型组和CTX组，表明沙葱多糖组可以改善S180腹水瘤小鼠的生存状态，提高生存质量，抑制腹水的形成，提高肿瘤小鼠的存活率。尤其以沙葱多糖高浓度组效果最为显著;此外在解剖剥离瘤块时发现，模型组小鼠的瘤块明显增大,界限不清、质地柔软,不易剥离，有的浸润到肝脏和脾脏，但沙葱多糖组和环磷酰胺组瘤块体积较小,界限清晰,质地较硬易剥离;小鼠腹水瘤形成后出现免疫器官指数的异常,表现为脾脏指数与胸腺指数均降低。胸腺和脾脏分别是机体主要的中枢免疫器官和外周免疫器官,它们能从一定程度上表达免疫功能的状况。胸腺、脾脏指数的大小直接反映机体免疫水平的高低。环磷酰胺组小鼠的胸腺、脾脏指数明显降低,表明小鼠免疫功能受到抑制，尤其是细胞免疫严重抑制,导致环磷酰胺组小鼠生存状况下降;然而沙葱多糖组小鼠的胸腺、脾脏指数比环磷酰胺组和模型组小鼠明显提高,表明沙葱多糖能通过促进腹水瘤小鼠免疫器官的生长发育而增强其免疫功能。

机体的免疫功能包括细胞免疫和体液免疫两方面，与肿瘤的发生发展关系密切，尤其是细胞免疫在肿瘤清除中起主导作用。已知肿瘤能诱发产生抑制性T细胞和抑制性巨噬细胞,它们能抑制淋巴细胞产生IL－2，促进肿瘤生长。IL－2活性在一定程度上反映了机体的免疫监视功能。其主要生物活性是促进T淋巴细胞和NK细胞的增殖，促进B细胞分化和增殖,促进抗体生成等。因此IL－2在抗肿瘤免疫中具有重要作用。IL－2也是机体重要的免疫调节因子,对多种免疫活性细胞均具有阳性促进作用,如IL－2诱导细胞毒性淋巴细胞(CTL)的分化,诱生淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)，CTL和LAK细胞皆是重要的杀瘤细胞。TNF－α是一种具有多种生物学活性的细胞因子,主要来源于单核细胞和巨噬细胞，T淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞及内皮细胞在一定条件下也能产生。TNF－α能够直接杀伤肿瘤细胞和诱导肿瘤细胞的凋亡,可以参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染,可以诱导细胞分化和促进单核细胞或T细胞分泌多种细胞因子。我们的整体实验也证明了沙葱多糖在抑制小鼠腹水瘤形成的同时可以提高小鼠血清中IL－2和TNF－α水平，结果显示，沙葱多糖的抑瘤效应与恢复和增强腹水瘤小鼠机体细胞的免疫功能及分泌IL－2和TNF－α有关。由于肿瘤目前最常用的治疗方法——放射治疗和化学治疗都存在着抑制机体免疫功能等严重的副作用,而沙葱多糖所具有的增强免疫活性的作用,将使其在肿瘤的治疗中显现好的前景。

5 结论

沙葱多糖能有效地抑制S180腹水瘤小鼠腹水的形成，延长其存活期，并通过促进免疫器官的生长发育和小鼠免疫细胞分泌IL－2、TNF－α而发挥免疫调节功能和抗肿瘤作用。