解毒脱瘾汤对吗啡依赖大鼠脑内多巴胺及其代谢产物的影响

朱成全，洪加津，白建萍，叶汉深

（解放军第421医院，广东 广州 510318）

解毒脱瘾汤对吗啡依赖大鼠脑内多巴胺及其代谢产物的影响

朱成全，洪加津，白建萍，叶汉深

（解放军第421医院，广东 广州 510318）

目的 观察解毒脱瘾汤（JTD）对吗啡依赖大鼠大脑内不同脑区多巴胺及其代谢产物的影响。方法 采用大鼠吗啡依赖戒断模型，观察解毒脱瘾汤对吗啡依赖大鼠大脑内不同脑区多巴胺及其代谢产物的改变。结果 成瘾组大鼠PFC和NAc的DA含量与对照组比较显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01），而纹状体的DA含量与对照组比较显著降低，海马的DA含量两组之间差异无统计学意义；解毒脱瘾汤中、高剂量组与可乐定组均可降低海马、PFC、NAc的DA含量，差异有统计学意义（P＜0.01），但对纹状体的DA含量影响不大，差异无统计学意义；成瘾组大鼠PFC和NAc的DOPAC含量与对照组比较显著增高，成瘾组大鼠纹状体的DOPAC比对照组低，差异有统计学意义（P＜0.01），而两组大鼠海马中均未能检测到DOPAC；解毒脱瘾汤中、高剂量组与可乐定组均可降低PFC、NAc的DOPAC含量，对纹状体的DOPAC含量影响不大，差异无统计学意义。结论 吗啡依赖大鼠脑内可能存在多巴胺及其代谢产物障碍，解毒脱瘾汤可能通过改善吗啡依赖大鼠多巴胺物质含量变化，消除其戒断症状，从而达到治疗的目的。

解毒脱瘾汤；吗啡依赖；多巴胺；大鼠；神经递质；黄芪；钩藤；黄连

药物滥用(成瘾)是一种中枢神经系统疾病，即由于长期滥用成瘾性物质所引起的一种脑内的神经细胞形态结构、生物化学和功能改变的慢性脑病。由于滥用的药物都是神经活性物质，能改变脑递质的功能，故药物依赖过程涉及脑功能的改变。解毒脱瘾汤临床主要用于戒毒治疗，为进一步探讨其治疗阿片类依赖的作用机制，我们观察与吗啡成瘾大鼠相关的额叶皮质 (prefrontal codex，PFC)、海马、伏隔核(nucleus accumbens，NAc)和纹状体的DA及其代谢产物3，4-二羟苯酰乙酸(DOPAC)的变化，探讨解毒脱瘾汤对吗啡成瘾神经递质的改变。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 解毒脱瘾汤由解放军第421医院提供，由黄芪、钩藤、党参、元胡、细辛、栀子、鸡血藤、黄连、黄柏、生地、山药、茯苓、丹皮、当归、川芎等16味药组成，用时煎成浓缩液，2.0 g生药/mL；盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂，批号060114)；盐酸纳洛酮注射液(北京华素制药股份有限公司，批号为 0804031)；盐酸可乐定片(北京第三制药厂生产，批号770654)。

1.1.2 动物 成年健康雄性wistar大鼠20只，体质量180～220 g。购自南方医科大学动物实验中心(动物合格证号：2005A065，2005B01)。

1.1.3 试剂 DA和DOPAC标准品购自Sigma公司。甲醇为国产色谱纯，高氯酸、柠檬酸三钠、磷酸二氢钠为国产分析纯。

1.1.4 仪器 色谱条件色谱柱 ODS C18分析柱 (4.6 toni×250 mil，5 Ixm)，荧光检测器型号为：RF-10AXL。柱温：常温，荧光检测波长 λEX=585 BITI，λEM=333 nm。流动相(V∶V)：0.02 mol/L柠檬酸三钠-0.05 mol/L磷酸二氢钠∶甲醇=97∶3，流速：1.0 mL/min。进样量 30 μL。用外标法定量，以峰面积表示其含量。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 大鼠用剂量渐增法制作吗啡成瘾病理模型［1］，方法为：大鼠皮下注射，第1天10 mg/kg(bid)；然后隔日1次，每次增加10 mg/kg，至第6天末次注射50 mg/kg吗啡，建立吗啡依赖模型。而NS组则以NS代替吗啡同法注射。最后1次注射后2 h，两组分别随机选取3只大鼠，按4 mg/kg注射盐酸纳洛酮行催促戒断，观察并记录1 h内戒断症状及体质量的变化情况。以改进的柳田知司评分标准对记录症状及体质量变化进行评分，作为判断成瘾的指标。

1.2.2 动物分组、给药、采取标本 将实验动物随机分成6组：生理盐水(NS)组、吗啡+生理盐水(NS)组、吗啡+解毒脱瘾汤低剂量（JTDD）组、吗啡+解毒脱瘾汤中剂量（JTDZ）组、吗啡+解毒脱瘾汤高剂量（JTDG）组和吗啡+可乐定(CND)组，每组动物数均为10只，雌雄各半。大鼠用剂量渐增法制作吗啡成瘾病理模型[1]，方法为：2 d内皮下注射盐酸吗啡 8次，第 1天注射 6次，剂量分别为 10、15、20、25、30、35 mg/kg；第 2 天注射 2 次，剂量分别为 40，50 mg/kg；总剂量达225 mg/kg；而NS组则以NS代替吗啡同法注射。另解毒脱瘾汤低、中、高剂量各组还分别以浓缩液灌胃，剂量分别为 50、100、200 mg/kg；可乐定组灌胃盐酸可乐定(CND)0.2 mg/kg，吗啡+NS组等灌胃容量生理盐水，每天给药2次，共给药2 d。每组各取10只大鼠迅速断头处死，参照大鼠脑立体定位图谱，冰台上迅速分离海马、纹状体、NAc和PFC脑组织，分别精确称质量，加入1 mL 0.1 moL/L高氯酸溶液，置入1 mL组织匀浆器中，冰浴下匀浆，高速冷冻离心机15 000 r/min 4℃离心30 min，取上清液置入1.5 mL离心管，于-80℃备用。

1.2.3 标准品曲线的制定 参照刘恭平等[2]的方法并适当改进。标准品配制：DA，DOPAC纯品用0.1 moL/L高氯酸分别配成100 g/mL的储备液，分装后-80℃保存，临用时用流动相稀释。DA 稀释成 0.0125，0.025，0.05，0.1和0.2 μg/mL；DOPAC 稀 释 成 0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 μg/mL。试验用水均为超纯水。在上述色谱条件下，分别取30 μL进样检测，重复3次，取峰面积的平均值，以浓度Y对峰面积X做回归。

1.2.4 样品HPLC检测 按上述方法，分别对两组大鼠不同脑区的DA和DOPAC进行检测，测定值再除以相应脑组织的克数即为含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 吗啡成瘾模型大鼠的一般情况

随机选取的大鼠注射纳洛酮后1 h内均出现湿狗样颤抖、伸展、清理皮毛、站立、跳跃、齿颤、腹泻和体质量下降等戒断症状，评分也明显高于对照组。

2.2 解毒脱瘾汤对吗啡成瘾模型不同脑区DA含量的影响

成瘾组大鼠PFC和NAc的DA含量相对于对照组显著增高(P＜0.01)；而纹状体的DA含量与对照组比较显著降低(P＜0.01)；海马的DA含量两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。解毒脱瘾汤中、高剂量组与可乐定组均可降低海马、PFC、NAc 的 DA 含量，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。解毒脱瘾汤各剂量组与可乐定组对纹状体的DA含量影响不大，差异无统计学意义。结果见表1。

表1 解毒脱瘾汤对大鼠不同脑区DA含量的影响（±s，n=10，μg/g 湿质量）

表1 解毒脱瘾汤对大鼠不同脑区DA含量的影响（±s，n=10，μg/g 湿质量）

注：与 Mor+NS 比较 *P＜0.05，**P＜0.01；与 NS 比较△△P＜0.01。

组别NS Mor+NS Mor+CND Mor+JTDD Mor+JTDZ Mor+JTDG海马0.589±0.005 0.593±0.006△△0.595±0.003**0.584±0.006 0.562±0.006**0.579±0.004**额叶皮质0.315±0.028 0.824±0.019△△0.672±0.028**0.784±0.015 0.562±0.023*0.436±0.013**伏隔核2.281±0.076 3.412±0.163△△2.781±0.159**3.156±0.188 2.648±0.179**2.407±0.162**纹状体5.912±0.163 3.168±0.081 4.242±0.128 5.217±0.126 4.318±0.170 4.217±0.165

2.3 解毒脱瘾汤对吗啡成瘾大鼠不同脑区DOPAC含量的影响

成瘾组大鼠PFC和NAc的DOPAC含量与对照组比较显著增高，差异有统计学意义(P＜0.01)；成瘾组大鼠纹状体的DOPAC比对照组低，差异有统计学意义(P＜0.05)；而两组大鼠海马中均未能检测到DOPAC。解毒脱瘾汤中、高剂量组与可乐定组均可降低PFC、NAc的DA含量，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。解毒脱瘾汤各剂量组及可乐定组对纹状体的DA含量影响不大，差异无统计学意义。结果见表2。

表2 解毒脱瘾汤对大鼠不同脑区DOPAC含量的影响（±s，n=10，μg/gs湿质量）

表2 解毒脱瘾汤对大鼠不同脑区DOPAC含量的影响（±s，n=10，μg/gs湿质量）

注：与 Mor+NS 比较 **P＜0.01，*P＜0.05；与 NS 比较△△P＜0.01。

组别NS Mor+NS Mor+CND Mor+JTDD Mor+JTDZ Mor+JTDG纹状体1.164±0.024 0.429±0.027 0.826±0.028 0.789±0.026 0.618±0.017 0.617±0.016海马------额叶皮质0.031±0.002 0.122±0.014△△0.042±0.018**0.058±0.021*0.052±0.023*0.036±0.014**伏隔核0.669±0.225 0.712±0.012△△0.705±0.013**0.646±0.015**0.648±0.018**0.647±0.016**

3 讨论

近年研究证实NAc与动机行为和奖赏行为密切联系，是成瘾药物的作用基础。海洛因的代谢产物通过阿片受体介导抑制了腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)中间神经元上的γ-氨基丁酸(γ-GABA)的释放，从而解除了其对VTA多巴胺能神经元向NAc等脑区投射DA的抑制作用[3]。研究发现吗啡成瘾过程中NAc内的DA量呈明显上升趋势，证实了这个奖赏通路的存在，NAc在海洛因奖赏效应中起关键作用[4]。NAc内的DA在大鼠成瘾后明显升高，而其更新率反而比对照组下降，也许与其功能是相适应的。与NAc相似，PFC也接受VTA的DA的投射，大鼠成瘾后PFC的DA含量明显上升，其更新率也明显加快。PFC参与了物质成瘾相关的认知、行为和情绪的变化的调节和控制。海马是参与药物成瘾和条件线索学习和记忆过程的重要脑区[5]。

本研究发现吗啡成瘾过程中海马中的DA含量并没有明显变化，也未能检测到其代谢产物，能否说明吗啡成瘾过程中，DA不是参与海马学习记忆相关突触传递的主要神经递质，有待于我们深入研究。同时研究发现，解毒脱瘾汤中、高剂量组均可降低均可降低海马、PFC、NAc的DA及其代谢产物DOPAC含量；解毒脱瘾汤各剂量组纹状体的DA及其代谢产物DOPAC含量影响不大。

中医学认为阿片类物质最易耗气伤阴，损精耗液，依赖后可出现气虚、精亏、血瘀、火旺等症状，严重时元气耗竭，脏腑阴阳俱损。根据其病因病机我们拟定解毒脱瘾汤[6]，以黄连、黄柏、栀子清热解毒，排除毒邪为君药；生地、丹皮凉血清营，共为臣药；川乌、细辛既可温肾壮阳以逐内寒，又可合元胡、钩藤舒筋通络而止痛，当归、黄芪、生地、鸡血藤，可益气养阴生血，以上诸药共为辅佐；另酌加山药、茯苓补脾益气而扶助后天之本，使气血生化之源得以补益，以此为使药。本研究结果表明，解毒脱瘾汤对吗啡依赖大鼠相关脑区的多巴胺及其代谢产物有一定的调节作用，但其具体作用机制尚待进一步研究。

[1]陈艳明，田育望.硕苞蔷薇化学成分对抗吗啡戒断症状的实验研究[J].湖南中医学院学报，2000，21（1）：6-7.

[2]刘恭平，石年，梁骏华，等.拟除虫菊酯对大鼠脑黑质纹状体系统多巴胺及其代谢产物的影响 [J].中华劳动卫生职业病杂志，2005，22(5)：368-370.

[3]Agarwal RK,Pandey US,Dixit,et al.Role of dopaminergic system in opioid-induced cardiovascular responses in dog[J].Indian J Med Sci,1989,43(12):323.

[4]Aley KO,Levine JD.Different mechanism mediate development and expression of tolerance for peripheral mu-opioid antinociception in rat[J].J Neurosci,1997,17(20):8 018.

[5]De Souza Silva MA，Mattem C，Hacker R，et a1.Intranasal administration of the dopaminergic agonists L-DOPA，amphetamine，and cocaine increases dopam ine activity in the neostriatum：a microdialysis study in the rat[J].J Neurochem，1997，68(1)：233-239.

[6]蒙桂珍，李 锐，周莉玲，等.解毒脱瘾汤对吗啡依赖性大鼠镇痛及生殖功能的影响[J].广州中医药大学学报，2002，19（3）：218-220.

Effects of Jiedu Tuoyin decoction on brain dopamine and its metabolites in morphinistic rats

ZHU Cheng-quan,HONG Jia-jin,BAI Jian-ping,YE Han-shen
(421 Hospital of People's Liberation Army,Guangzhou,Guangdong 510318,China)

ObjectiveTomeasure theeffectsofJiedu Tuoyin decoction (JTD)on brain dopamine and its metabolites in morphinistic rats.MethodsThe detoxification models of morphinistic rats were used to observe the effects of JTD on the brain dopamine and itsmetabolitesin differentbrain regions.ResultsCompared with the controlgroup,the DA content of PFC and the NAc in addicted group were significantly higher(P＜0.01),while the DA content in striatum was lower,and the DA content in the hippocampus was not significant;in the middle-dose and high-dose of JTD groups and the clonidine group,the DA content of hippocampus,PFC and NAc lowered(P＜0.01);the DA content in the striatum was not so affected in the each dose of JTD groups and the clonidine group,which was no statistical significant difference;compared with the control group,the DOPAC content of PFC and NAc in addicted group were significantly higher,and DOPAC in striatum was lower(P＜0.01),while DOPAC were not detected in the hippocampus;all the DA contents of PFC and NAc in the middle-dose and high-dose of JTD groups and the clonidine group lowered,and the striatal DA content was not influenced in those groups,the statistics difference was no significant.ConclusionThere may exists obstacles of brain dopamine and its metabolites in brain of morphinistic rats,and JTD may be effective to improve the morphine content of dopamine material changes for elimination ofthe withdrawal symptoms.

Jiedu Tuoyin decoction;morphine dependence;dopamine;rats;neurotransmitter;Astragalus mongholicus;ramuliet spina uncariae;coptis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.009.028.03

2009-12-10

海军卫生部科研基金资助项目(00HW04)。

朱成全(1969-)，男，安徽望江人，副主任医师，主要从事中西医结合脑病研究。

（本文编辑 彭芝配）