硒化壳聚糖促进体外培养皮肤成纤维细胞增殖

邓守恒 杨敬宁 曹凤军 蔡晓军 邓守平 陈萍

壳聚糖 [β(1,4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖]是一种来源于海洋生物的碱性生物多糖,具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种生物活性,且生物相容性良好,几乎无毒性及其他不良反应,在现代药物制备中经常作为良好的药物材料进行开发[1]。硒是人和动物体内必需的微量元素之一,亦具有广泛的抗氧化,抗肿瘤,抗炎等活性,硒化壳聚糖[2]是将壳聚糖与亚硒酸在酸性条件下,以混合金属离子为催化剂,通过拼合原理制备的有机硒,具有硒和多糖的双重功效。本实验观察了硒化壳聚糖对体外培养的人皮肤成纤维细胞增殖的影响,并分析了可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 硒化壳聚糖由福建医科大学药化系合成,含硒量为 0.4%;DMEM培养基、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)及小牛、胎牛血清购自 Gibco公司;乳酸脱氢酶(LDH)、四甲偶氮唑蓝(MTT)购自 Sigma公司;3H-脱氧胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR)购自北京中国原子能研究所。

1.2 实验仪器 多孔细胞样品收集器(上海分析仪器总厂);倒置显微镜(日本 Olympus公司);BeckmanLX20全自动生化测定仪(美国 Beckman Coulter公司);Medal680酶标仪(美国 Bio-Rad公司);LS3801型液闪计数仪(美国 Beckman Coulter公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养：将术中取下的包皮在无菌条件下漂洗,剪成1mm×1mm×1mm组织块,培养于含 15%胎牛血清的DMEM培养液中,置 37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,每 3天换 1次液,待长成致密单层后,用浓度为 2.5 g/L的胰酶消化,按体积比为 6传代,第 6代细胞用于实验[3],用细胞培养液配制硒化壳聚糖,根据硒化壳聚糖浓度不同分为空白对照组、25、50、100、200、400mg/L共 6组。

1.3.2 倒置显微镜观察：取第 6代细胞,5×108个/L接种于24孔板,每孔接种 0.5ml,CO2箱培养 24 h后分为试验组和对照组继续培养 48h,于倒置显微镜下观察,照相。

1.3.3 MTT法检测硒化壳聚糖对细胞增殖活性的影响 取第6代细胞,5×103个/ml接种于 96孔板,每孔接种 100μl,CO2箱培养 48 h,按分组加入不同浓度的硒化壳聚糖继续培养24 h,换培养液为 DMEM(100μl/孔),加入浓度为 5 g/L的MTT(25μl/孔)继续培养 4h后加入二甲基亚砜(100μl/孔),于波长 540 nm处测各光密度值。

1.3.4 硒化壳聚糖对细胞生长动力学的影响：取第 6代细胞,5×103个/m l接种于 96孔板,每孔接种 100μl,CO2箱培养24 h贴壁后按分组加入不同浓度硒化壳聚糖继续培养,每天消化加药孔和对照孔各 3孔细胞计数,计算均值,隔天给未计数的细胞换液并加药,以培养时间为横轴,细胞数为纵轴绘制生长曲线,倍增时间的计算公式[4]：细胞倍增时间 =培养时间(d)×log2/(log起始细胞数 -log培养后细胞数)。

1.3.5 3H-TdR掺入法测定 DNA合成[5]：取第 6代细胞,5×103个/m l接种于 96孔板,每孔接种 100μl,CO2箱培养48h,按分组加入不同浓度的硒化壳聚糖继续培养 24 h后加入3H-TdR 37MBq/L,继续培养 24 h后用 0.25%胰酶消化并转移至玻璃纤维滤纸上,依次用 0.9%氯化钠溶液、10%三氯醋酸、无水乙醇冲洗固定干燥后加闪烁液,液闪计数仪测定每分钟闪烁次数值(counts perminute,cpm)。

1.3.6 LDH漏出率的测定[6]：取第 6代细胞,5×103个/ml接种于 96孔板,每孔接种 100μl,CO2箱培养 48 h,按分组加入不同浓度的硒化壳聚糖继续培养24 h,用全自动生化分析仪检测上清液中 LDH的含量,将培养板中的细胞用 0.25%胰酶消化,收集细胞,超声波粉碎后加入 PBS液,用全自动生化分析仪检测 LDH的含量,LDH漏出率的计算公式：漏出率 =(LDH上清液-LDH胞内)/LDH胞内。

1.4 统计学分析 应用 SPSS 12.0统计软件,计量资料以±s表示,采用 t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察结果 6组细胞均呈放射状排列,排列规则整齐,胞体较大,生长良好,各药物浓度组与空白对照组相比,外观形态未发生明显改变。见图 1。

2.2 MTT法及3H-TdR掺入法检测硒化壳聚糖对成纤维细胞增殖影响 硒化壳聚糖能促进成纤维细胞增殖,25mg/L及以上浓度硒化壳聚糖即可使成纤维细胞数量增加,对 540 nm波长光线吸收增多,促进成纤维细胞对 3H-TdR的掺入。50mg/L硒化壳聚糖组吸光度值大于空白对照组(P＜0.05)。400mg/L硒化壳聚糖组 cpm值大于空白对照组(P＜0.01)。见表 1、图 1。

表1 硒化壳聚糖对体外培养成纤维细胞增殖的影响±s

表1 硒化壳聚糖对体外培养成纤维细胞增殖的影响±s

注： 与空白对照组比较,＊P＜0.05,#P＜0.01

组别 吸光度值(A) cpm值空白对照组 0.481±0.02 1 0564±356 25 mg/L硒化壳聚糖组 0.513±0.02 1 4872±390＊50 mg/L硒化壳聚糖组 0.558±0.01＊ 1 5281±365＊100mg/L硒化壳聚糖组 0.602±0.01＊ 1 5821±487＊200mg/L硒化壳聚糖组 0.627±0.01＊ 1 6734±397＊400mg/L硒化壳聚糖组 0.633±0.02＊ 1 8658±356#

2.3 硒化壳聚糖对成纤维细胞生长动力学及 LDH漏出率影响 从生长曲线来看各浓度硒化壳聚糖组成纤维细胞增殖均比空白对照组明显增快,先于空白对照组细胞数量达到饱合密度而进入停滞期,随后细胞出现退化死亡。根据公式计算可知,400mg/L硒化壳聚糖组的群体倍增时间与空白对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01),其他各浓度组细胞群体倍增时间均比空白对照组有所缩短。硒化壳聚糖可降低皮肤成纤维细胞 LDH漏出率,随着药物剂量的加大漏出率降低越来越明显,呈现剂量依赖关系,当剂量 ＞100mg/L时,对 LDH漏出率的影响与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 2、图 1。

图 1 硒化壳聚糖对皮肤成纤维细胞生长曲线的影响

表 2 硒化壳聚糖对皮肤成纤维细胞倍增时间和 LDH漏出率的影响±s

表 2 硒化壳聚糖对皮肤成纤维细胞倍增时间和 LDH漏出率的影响±s

注：与空白对照组比较,＊P＜0.05,#P＜0.01

组别 倍增时间(d) LDH漏出率(U/ml)空白对照组 3.54±0.01 25.11±1.26 25 mg/L硒化壳聚糖组 3.19±0.01 23.76±1.14 50 mg/L硒化壳聚糖组 3.05±0.01＊ 23.21±1.76 100mg/L硒化壳聚糖组 2.84±0.01＊ 17.61±1.29＊200mg/L硒化壳聚糖组 2.80±0.01# 16.23±1.17#400mg/L硒化壳聚糖组 2.74±0.01# 15.98±0.89#

3 讨论

MTT是一种黄色的水溶性染料,活细胞线粒体内膜上具有有活性的琥珀酸脱氢酶,该酶可使黄色的 MTT还原为蓝紫色的甲臢颗粒,活细胞数量越多,细胞内甲臢颗粒越多,其对540nm波长光线吸收也越多,我们可通过测定细胞在540 nm波长处吸光度值来了解活细胞数量多少,吸光度值越大,活细胞数目就越多,细胞增殖也就越旺盛。本实验中,笔者采用 MTT法检测了硒化壳聚糖对成纤维细胞增殖的作用并研究了其对细胞动力学的影响,结果显示硒化壳聚糖能明显促进成纤维细胞增殖,25mg/L硒化壳聚糖作用成纤维细胞 24 h,即可使细胞增殖加快,数量增加,浓度越高,效果越明显。细胞生长曲线图也显示,各浓度硒化壳聚糖均可促进成纤维细胞增殖,比空白对照组先进入平台期,成纤维细胞经各浓度硒化壳聚糖处理后,细胞群体倍增时间均比空白对照组有所缩短。

脱氧胸腺嘧啶核苷酸是合成DNA的原料之一,细胞分裂增殖旺盛则 DNA合成加快,细胞对脱氧胸腺嘧啶核苷酸的需求量增加。本研究采用 3H-TdR掺入量测定发现硒化壳聚糖可增强成纤维细胞对 3H-TdR掺入量,促进成纤维细胞DNA复制合成,与MTT检测结果一致。LDH是存在于细胞浆内参与糖酵解反应的酶,进行离体细胞培养时,如果培养的细胞受损,LDH会由细胞漏出至培养液中,通过测定培养液中 LDH可衡量细胞受损的程度,如果加入药物干预,可用于药物安全性的考察[7]。本实验通过测定成纤维细胞培养液中LDH和细胞内LDH相对量来评价硒化壳聚糖对成纤维细胞损害情况,结果显示硒化壳聚糖并没有增加LDH的漏出率,反而能降低 LDH漏出率,对细胞起一定的保护作用,同时光镜下观察成纤维细胞形态上未出现明显受损改变,显示其不良反应较小,其药用价值值得进一步研究。

1 Zarzycki R,Modrzjewska Z.Use of chitosan in medicine and biomedical engineering.Polim Med,2003,33：47-58.

2 孙兰萍,张胜义,许晖.硒化壳聚糖的制备及理化性质的研究.食品工业科技,2006,27：145-151.

3 黎鳌,杨宗诚主编.实验烧伤外科学.第 1版.重庆：重庆大学出版社,1997.268-269.

4 Tomas P.Vickery Trinkaus-Randall.Regulation ofbasic fibroblastgrowth factor binding and activity by cell density and heparan sulfate.The Journal of Biological Chemistry,1999,274：534-540.

5 Shin VY,Liu ES,Koo MW,et al.Cigarette smoke extracts delay wound healing in thestomach：involvementofpolyam ine synthesis.Exp Biol Med(Maywood),2002,227：114-124.

6 洪庆涛,宋岳涛.细胞培养液乳酸脱氢酶漏出率的比色测定及其应用.细胞生物学杂志,2004,226：74-79.

7 Lobner D.Comparison of the LDH and MTT assays for quantifying cell death：validity for neuronal apoptosis.Journal of Neuroscience Methods,2000,96：147-152.