副溶血弧菌的快速鉴定检测方法研究进展

杨芳 李秀娟 徐保红

副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus,VP)是一种革兰阴性嗜盐杆菌,是引起食源性疾病的重要病原之一。该菌主要分布于沿岸海水、海河交界处及海产品中,是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌。它在海产品上的带菌率高达45.7%[1],其生长速度是一般细菌(如大肠杆菌、沙门氏菌等)的 2倍,因而更易于引起食物中毒。常规的 VP的检测方法包括增菌培养、选择性培养、生化试验和血清学反应等过程,耗时长、操作繁琐、检出率低,不适应实际检验工作的需要。随着科学技术的发展,一些快速检测方法以其特异性强、敏感性高、分辨率高、操作简单、稳定性好、耗时短的优点逐渐取代常规的检测方法,在病原菌检测方面有着广泛的应用前景。本文就VP的快速检测方法综述如下。

1 聚合酶链式反应(PCR)技术

由于 PCR技术具有敏感、快速、特异性强、操作简单等特点,在微生物的鉴定检测方面展现了巨大的潜力。以常规的分离培养方法检测 VP耗时长,需要 4～5 d,而采用 PCR法进行检测,只需要 10 h,不仅节省了时间,且可提高检测通量,一次可检测多达 96份样品。Kim等[2]建立了以 toxR基因为靶基因采用 PCR方法检测了 373株 VP和 290株其他菌株,结果表明373株VP都携带toxR基因而非 VP菌株结果均为阴性。Venkateswaran等[3]针对 VP的 gyrB基因进行 PCR引物设计,扩增片段大小为 285 bp,运用该 PCR方法检测来自环境、食品和临床样品中的 VP,共 117菌株,结果表明所有的菌株都能扩增出258bp的基因片段。除了 toxR、gyrB基因外,也可采用 tl、tdh、tlh、trh、Fla基因和 pR72H片段等[4-8]来检测 VP。

1.1 多重 PCR技术 Bej等[9]针对 VP的 tlh基因、tdh基因、trh基因用多重 PCR方法检测贝类中的 VP。检测结果表明：从临床、海产品、环境和牡蛎中分离得到的 111份 VP菌株,用该方法对所有的 VP菌株全部扩增出tlh基因,60份 VP菌株扩增出 tdh基因,43份VP菌株扩增出trh基因。该方法的灵敏度较高,10 g牡蛎组织增菌肉汤的最低检测量为 10～100 cfu[10]。吴彩云等[11]通过对反应体系中各组分含量的优化及循环参数的摸索,确立了同时检测 t1和tdh基因的多重 PCR技术,结果与常规 PCR的一致。该法不仅具有常规 PCR的优点,而且还能节省时间及 Taq酶、dNTP等材料,还可尽量减少或避免因操作步骤过多因污染所带来的假阳性等问题[12]。

1.2 实时 PCR方法 实时 PCR由于扩增与检测在封闭单管内进行,因此能够避免常规PCR方法易污染的缺点,并且实现了 PCR从定性到定量的飞跃,具有很好的应用前景。Kaufman等[13]针对tlh基因建立了检测VP的实时荧光定量 PCR方法,结果表明该方法可在 1 h之内定量检测出牡蛎中的VP。Takahashi等[14]针对 VP的 toxR基因也建立了实时荧光定量 PCR方法检测海水、贝类中的 VP,最低检出限为 36 cells/m l。Blackstone等[15]建立的一种基于荧光探针的检测 VP的(针对其 tdh基因)实时 PCR方法。结果表明,只有携带 tdh基因的 VP能产生荧光信号,并且与携带tdh基因的阴性弧菌或者其他细菌无交叉反应。该方法检测 VP的tdh基因特异性强(仅检测携带tdh基因的阳性 VP),灵敏度高(1 cfu/PCR反应体系),快速(整个实验 24h内就可以完成,检测不到 1h就可完成)。Ward等[16]建立了基于TaqMan荧光探针的多重实时 PCR方法检测贝类中 VP的 tlh、tdh、trh和 ORF8基因,结果表明该方法可用于检测基因组 DNA和菌纯培养物,其灵敏度分别为 200 pg和1×104cfu/m。

1.3 MPN-PCR方法 MPN法(most probable number,最可能数法)采用多管发酵法,通过几率计算,测定样品中细菌的最可能数,达到定量的目的。MPN法与 PCR法的结合可达到定量和提高检出限的目的。栾晓燕等[17]根据 VP的 tdh、trh、tlh基因序列设计了 3对特异性引物,通过增菌培养、样品处理、PCR扩增,并且结合了MPN法,实现了对水产品中的 VP快速定量检测。该方法的最低检出限为12 cfu/ml比直接进行PCR扩增的最低检出限(1.22×103cfu/m l)提高了 100倍,对 tlh、tdh、trh基因的特异性强,整个检测过程不超过 16 h。Blanco-Abad等[18]分别用 A/P(Absence-Presence)-PCR和 MPN-PCR法进行鉴定 VP,比较了这两种方法的高效性和灵敏性,结果证明MPN-PCR法优于 A/P-PCR法,可实现快速、准确检测 VP。

2 UPPCR-SSCP

通用引物 PCR(UPPCR)和单链构型多态性(SSCP)相结合进行检测具有很高的灵敏度和特异性,可以将病原菌分辨到种。16s RNA基因因保守性高,又有一定的随科、属、种不同而有不同程度差异的变异区,被认为是分类及临床检测鉴定的最有用的靶基因。以细菌 16s-RNA基因保守区设计引物,对其可变区进行 PCR扩增后,结合特异性探针杂交、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)或直接测序等手段就可以把病原菌定位至种。彭宣宪等[19]以 16s RNA基因为目的片段,采用通用引物 PCR配合 SSCP分析(UPPCR-SSCP技术),对弧菌科弧菌属中的 VP、溶藻酸弧菌等进行了检测。结果发现 SSCP技术能较好地鉴别细菌的不同种,但对同种不同株细菌的区分较困难。结合对不同科属种细菌的 UPPCR的结果,可以认为种间差异的 SSCP图谱与亲缘关系似乎有一定联系,即亲缘关系越近则差异越小;反之,则差异越大。总之,若建立有关病原菌的 SSCP电泳图谱,可用于病菌的快速检测。

3 DNA杂交

Mccarthy等[20]建立了两个无辐射探针碱性磷酸酶(AP)标记的探针和地高辛(DIG)标记的探针检测 VP的 tlh基因。对26株 VP、88株其他弧菌和 10株非弧菌物种用 AP标记探针进行特异性实验,结果表明只有 26株 VP弧菌与 AP探针杂交,种属特异性强。对从牡蛎中分离的 206株疑似VP的检测结果显示 AP标记探针和API-20E鉴定的结果一致性为 97%。对 584株疑似 VP的检测结果显示AP标记探针和DIG标记探针检测结果一致性达 98%。基于 AP和 DIG标记探针的方法,Gooch等[21]通过AP探针(Direct-VPAP)和 DIG探针(Direct-VPDig)以及 MPN-VPAP3种方法对不同季节和储存条件下的牡蛎中VP进行定量检测,结果经回归分析显示 MPN-VPAP方法检测VP与 Direct-VPAP、Direct-VPDig方法检测 VP的效果是一致的,但灵敏度不同。对 0.1 g的样品进行检测结果表明 MPNPCR法的灵敏度为 3MPN/g,而其他两种方法的灵敏度为10 cfu/g,因此MPN-PCR法在 VP低浓度时表现出高灵敏性。而在 VP含量较高时利用 Direct-VPAP、Direct-VPDig方法进行检测,则更快速、经济和省力。Banerjee等[22]建立了一种 DNA探针快速检测 VP的方法。在hydrophobic grid membrane filters(HGMF)方法中,将固定在 HGMF上 VP-DNA模板与 DIG标记的 tdh基因探针进行杂交后检测VP。尽管经过富集培养后可以在 1 d之内检测出VP,但是由于该方法引入了 DNA分离、DIG标记探针的合成、VP引物的设计和克隆杂交,使其操作步骤复杂化。

4 LAMP检测方法

LAMP(核酸扩增-环介导等温扩增技术)是一种新颖的检测VP的方法。LAMP技术依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的 4条特异性引物和一种具有链置换活性的 DNA聚合酶在恒温条件下对核酸进行扩增,具有高特异性、快速简便、高效性等特点。徐芊等[23]针对VP的tlh基因设计四条特异性引物进行 LAMP扩增,并对扩增反应进行优化,反应时间为 1 h,反应温度为 60℃。结果表明 LAMP检测 VP特异性强、检测灵敏度高、操作简便、检测成本低,有望发展成为快速检测VP的有效手段。

5 Transcrip tion-reverse transcrip tion concerted(TRC)方法

TRC是用于检测mRNA的一种新研制的方法,它是将目标RNA序列反转录成 cDNA,经过dsDNA转录成 RNA后插入活性荧光 DNA探针(INAF DNA探针),通过实时荧光检测器在一恒定的温度下定量检测 TRC反应中的荧光强度,然后根据反应时间和荧光强度比率作图。在 tdh-TRC与trh-TRC方法中反应 30m in后,样品的荧光强度比率≥1.2认为是阳性,＜1.2的为阴性。Masuda等[24]新建立了快速、灵敏的 TRC方法定量检测 VP中 tdh和trh基因的 mRNA转录。针对提取来自 24株VP,31株其他弧菌属,8株非弧菌属的 RNA检测结果表明：用TRC方法分别检测tdh和 trh的 mRNA的结果与用 DNA克隆技术检测结果一致,灵敏度为 100 cfu。但 tdh-TRC只检测 tdh mRNA;菌株携带任何 tdh的不同基因(tdh1-tdh5)都呈现阳性的结果而携带 trh基因(trh1或 trh2)都呈阴性。同理,trh-TRC方法只对携带trh基因的VP表现出阳性结果。因此,TRC方法检测 VP的致病基因具有简单、特异、快速的特点,同时 TRC原理也可用于检测其他致病菌。

6 免疫学方法

6.1 间接免疫荧光抗体方法 樊景凤等[25]建立了 VP的间接免疫荧光抗体检测方法,该方法将细菌固定于载玻片上,滴加免疫血清,37℃孵育 30 m in;用 PBST(含 0.5%Tween-20的0.01mol/L,pH=7.4的 PBS)洗涤 3次,滴加 FITC标记的羊抗兔 LgG,37℃孵育 30m in;用 PBST洗涤 3次,干燥后滴加 PBS缓冲的甘油(PBS∶甘油 =1∶9)1滴,加盖玻片,在其上加 1滴无自发荧光的香柏油,用落射荧光显微镜进行观察。交叉反应和阻断试验证明该方法的特异性较高,并且该方法具有快速、简单的优点适用于现场的应用推广。

6.2 间接酶联免疫吸附法 窦勇等[26]建立了用于 VP的间接酶联免疫吸附法。该方法标准化后进行测定,交叉实验与阻断实验表明其具有较高的特异性,并且检测时间短,准确度高,可快速检测 VP。王军等[27]用 0.5×10-3(V/V)甲醛、30℃作用8 h灭活病原菌制成菌苗。用该菌苗免疫新西兰兔获得特异性抗血清,以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为标记第二抗体,对 VP进行间接 ELISA快速检测,其最低检测极限为 5×104cfu/cm3。现场检测即将大黄鱼肝脏粗研磨后加入 5倍体积的无菌 0.9%氯化钠溶液继续研磨,取上清液检测;水样直接检测。结果表明间接 ELISA检测法可用于 VP的快速检测。

6.3 斑点 ELISA法 斑点 ELISA法是一种样品处理上的创新方法,针对 VP产生 TDH和 TRH的特点,将菌株培养液的上清点样于硝基纤维膜上,干燥后以 BSA封闭,再在点样处加TDH和 TRH抗体,过夜后与第二抗体反应,最后加底物产生颜色反应指示结果。很显然这种方法更适合处理大量样本。臧红梅等[28]用斑点ELISA技术检测VP,通过交叉实验与阻断实验表明该方法的特异性好,重复性好,批内和批间结果相同,无差异。通过免疫血清敏感性试验结果得知,当 VP菌量低于104cfu/ml时,不易检出。斑点ELISA法虽然特异性强,但灵敏度不高,还有待进一步提高其灵敏度。提高灵敏度的方法有：AB(avidin biotin system)-ELISA法;PCR-ELISA法;斑点免疫酶结合试验(DIA)等。

7 荧光分析法

VP具有代谢阿拉伯糖的能力,在阿拉伯糖-葡萄糖醛酸盐培养基(AG)培养基上经过选择性增菌后的VP具有较高胰蛋白酶样活性,而其他菌株的胰蛋白酶活性则可忽略,并且VP胰蛋白酶活性不受其他菌株浓度的影响,仅与增菌前VP的浓度有关。高旗利等[29]用此方法检测水产品中是否污染有 VP。结果表明该方法灵敏度为20个/g,只需 8h就可完成水产品中VP的初筛检验。操作简便、灵敏度较高,适于快速检测需要。

8 传感器技术

8.1 电化学技术 抗原-抗体结合前后可导致多种信号的改变,如：重量、光学、热学、电化学等,电化学免疫传感器可通过感应抗原-抗体结合前后的电化学变化来实现对病原微生物的定性和定量检测。Zhao等[30]将HPR标记VP抗体掺于琼脂糖和纳米金中并修饰于丝网印刷电极的表面,制备一次性电化学免疫传感器来快速检测VP。然后采用循环伏安法表征免疫电极和检测酶促反应,根据免疫复合物屏蔽 HRP活性中心引起还原电流的变化来定量检测VP。在优化的实验条件下,免疫电极的线性检测范围为 105～106cfu/m l,检出限为 7.4×104cfu/ml(S/N=3)。该免疫电极具有较好的特异性、重现性(RSD＜6%)、稳定性(1周后电流响应为初始值的 91%)和准确性(与 ELISA符合率为 97.5%),可用于 VP的快速筛选。

8.2 电子鼻技术 微生物在生长代谢过程中可产生特有的挥发性代谢产物,具有微生物种的特异性,而电子鼻技术是检测挥发性成分的人工嗅觉装置,针对微生物的挥发性代谢产物实现对微生物的检测。胡惠平等[31]利用电子鼻技术对从从南美白对虾中分离的一株VP进行检测。实验采用具有 18个金属氧化物传感器的 Fox 4000电子鼻对 VP经纯培养后产生的挥发性代谢产物进行检测,同时用空白 3.5%氯化钠TSB培养液作为对照。将电子鼻获得的样品数据用主成分分析(PCA)、判别因子分析(DFA)、单类成分判别分析(SMICA)等多元统计方法进行分析。结果显示,VP经纯培养后产生了明显不同于空白培养液气味的挥发性代谢产物。可见,电子鼻可应用于纯培养微生物的检测,实现对VP无损、快速检测。

9 VP快速测试片

许如苏等[32]以法国进口弧菌显色培养基为主要原料,运用微生物测试片专有技术,制成一次性 VP快速检测片。并对其检测性能进行测试研究。结果表明该测试片对纯菌的检测灵敏度达到 8 cfu/m l,与霍乱弧菌、溶藻弧菌等 17种非目的菌无交叉反应;重复性试验结果相对偏差低 8%;24h可完成检验工作。应用该测试片检测人工染菌样品和自然样品,检测结果与GB或SN标准方法一致。因此,VP快速测试片具有敏感度高、特异性强、重复性好、操作简便等优点,可用于食品和水产品中 VP的快速初筛。

10 基因芯片(Gene Chip)

近年来基因芯片技术在微生物检测领域的发展将会充分发挥准确及高通量并行检测的优越性。以基因微阵列为基础的芯片,可大大提高工作效率,减少人为误差,实现微生物的自动化检验。李君文等[33]利用 16SrRNA基因作为检测的靶基因,在其恒定区设计 PCR引物,在可变区设计检测探针：用1对PCR引物就可以将所有细菌的相应基因片段全部扩增出来(扩增时 1条PCR引物采用荧光标记),再用每种细菌的特异性探针阵列与标记的靶片段进行杂交反应,杂交后用专用设备读取分析荧光信号,可以定性和半定量地检出致病菌。用这种芯片可以特异地检出水中 VP、军团杆菌、李斯特菌等。结果表明基因芯片技术检测水中常见致病菌可以实现高通量、并行检测,一次实验即可得出全部结果;特异性强、敏感性高、操作简便、快速(检测时间约 4h)。

以上总结了 VP各种快速检测方法,但综合来看,每种方法都有其优缺点,在定性和精确定量方面难以兼顾。微生物鉴定实验需要积累和吸取实验经验,技术含量高,但是随着分子生物学的飞速发展,新的技术、仪器设备不断出现,如基因芯片技术;检测技术也不断完善,特别是各种分子技术的融合与创新,如 PCR、DNA杂交、ELISA三大现代分子生物学技术的联用,为VP的快速检测提供了强大的工具,必将会实现VP快速、准确、灵敏、特异、大规模的检测。

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