舒巴坦钠和EDTA使产ESBLs鸡大肠杆菌恢复对抗菌药物敏感性

刘保光，刘建华，吴华，陈玉霞，胡功政，徐利纳，陈燕杰，孟春萍

（河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002）

产生超广谱 β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamases, ESBLs）是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药最重要的机制[1]．ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，大肠杆菌和肺炎克雷伯菌是其代表菌种，其他如沙门菌、枸橼酸杆菌等也可产生[2]．ESBLs的特点是其能水解氧氨基头孢菌素和氨曲南，但能被β-内酰胺酶抑制剂所抑制[3]．ESBLs产生菌，不仅对β-内酰胺环类抗生素耐药，而且也对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、氟苯尼考、多西环素耐药[4]，即呈多重耐药特点．将β-内酰胺环类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦钠联用，可大大提高其对产 ESBLs抗菌的活性[5]．舒巴坦钠与β-内酰胺环类联用的抗菌作用国内外已有报道[5-7]，膜通透性促进剂 EDTA能增加抗菌药物对细菌的抗菌作用国外已有报道[8]，在国内仅有 1篇[9]．关于舒巴坦钠、EDTA对产ESBLs菌的抗菌作用，河南农业大学兽医药理学实验室已有的研究结果表明，在动物方面，产ESBLs与膜通透性降低在细菌多重耐药产生中有协同作用，但首次研究试验菌株较少，仅有6株．为了使结果更具代表性，笔者选择 18株新近分离的产ESBLs鸡大肠杆菌，分别研究酶抑制剂舒巴坦钠、膜通透性促进剂EDTA及二者联用对抗菌药物敏感性的影响，为产ESBLs鸡大肠杆菌感染的控制提供理论依据．

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

18株产ESBLs鸡大肠杆菌，由河南农业大学兽医药理学实验室分离，是从24株鸡大肠杆菌分离菌中按CLSI方法[10]通过表型筛选和确证实验证实后选出的，经过法国生物梅里埃Vitek-32全自动细菌鉴定仪鉴定．质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，由中国普通微生物菌种保存中心提供．

1.1.2 培养基

主要培养基成分为 MH肉汤、麦康凯琼脂、MH（A）培养基和GN增菌液．

1.1.3 药敏纸片及药品

氨曲南 （AZT，每片30 μg）、头孢曲松 （CRO，每片30 μg）、头孢泊肟 （CPO，每片30 μg）、头孢噻肟 （CTX，每片30 μg）、头孢噻肟/棒酸 （CTC，每片30/10μg）、头孢他啶 （CAZ，每片30 μg）、头孢他啶/棒酸 （CAC，每片30/10μg）均由北京天坛药物公司提供．加替沙星（GAT）、乳酸环丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LEV）、磷霉素（FOS）、舒巴坦钠（SBT）、头孢噻呋（CTF）、头孢噻肟（CTX）、头孢吡肟（CPM）、多西环素（DOX）、阿米卡星（AK）和氟苯尼考（FLO）均由河南牧翔动物药业有限公司提供．

1.1.4 试验仪器

主要试验仪器为Vitek-32全自动细菌鉴定仪、磁力搅拌器、手提式电热压力蒸汽消毒器、隔水式电热恒温培养箱、电子分析天平、振荡培养箱、超净工作台、真空干燥箱、微量移液器．

1.2 方 法

采用微量肉汤稀释法，先测定左氧氟沙星、加替沙星等10种抗菌药对产ESBLs鸡大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC），再分别测定这些药物与舒巴坦钠、EDTA以及舒巴坦钠+EDTA联用的MIC．药物与舒巴坦钠的质量比为 2∶1，EDTA浓度为1/2MIC．标准菌株ATCC25922作为质控菌．耐药临界值按CLSI颁布的数值标准[10-11]判定．

2 结果与分析

10种抗菌药物及其与舒巴坦钠、EDTA、舒巴坦钠+EDTA联用对18株产ESBLs鸡大肠杆菌的抗菌活性见表1、表2．

表1 10种抗菌药及其与舒巴坦钠联用对18株产ESBLs鸡大肠杆菌的抗菌活性Table 1 Antibacterial activity of 10 antimicrobial drugs alone and in combination with sulbactam on 18 ESBLs-producing isolates from fowl E. coli

续表

从表1可以看出，18株产ESBLs鸡大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药率均达到 100%，加入舒巴坦钠后耐药率没有变化；对第三代头孢菌素类（头孢噻呋、头孢噻肟）的耐药率也较高，但加入舒巴坦钠后，对头孢噻肟的耐药率变为 0；对氟苯尼考、阿米卡星、磷霉素的耐药率达到100%，加入舒巴坦钠后都有所降低，对磷霉素的耐药率变为0；对多西环素的耐药率在加入舒巴坦钠前后没有明显变化．

表2 10种抗菌药分别与EDTA、EDTA+舒巴坦钠联用对18株产ESBLs鸡大肠杆菌的抗菌活性Table 2 Antibacterial activity of 10 antimicrobial combinations with EDTA and sulbactam+EDTA against 18 ESBLs-producing isolates from fowl E. coli

从表2可以看出，18株产ESBLs的鸡大肠杆菌对加入EDTA加替沙星的耐药率降至30%，但对加替沙星+EDTA+舒巴坦钠、环丙沙星+EDTA+舒巴坦钠的耐药率，与对加替沙星+EDTA、环丙沙星+EDTA的耐药率无差异．

综合分析表1、表2可知，对加入EDTA的头孢噻呋的耐药率与对头孢噻呋单用的耐药率没有变化，但对第三代头孢菌素类+EDTA+舒巴坦钠的耐药率比对第三代头孢菌素类仅与EDTA或舒巴坦钠联用的耐药率有所降低；对加入EDTA的多西环素、氟苯尼考、阿米卡星的耐药率均比对单药的耐药率低，对氟苯尼考、阿米卡星、多西环素分别与EDTA+舒巴坦钠联用的耐药率均比仅与EDTA或舒巴坦钠联用的耐药率低．

3 结论与讨论

本试验检测的产ESBLs鸡大肠杆菌均呈多重耐药特性，一是因为鸡大肠杆菌携带ESBLs的质粒同时携带有氟喹诺酮类、氨基糖苷类等多种抗菌药的耐药基因，使产ESBLs菌具有多重耐药表型[4]，二是因为产生ESBLs等特异性耐药机制和外膜通透性降低、主动外排作用等非特异性耐药机制协同存在导致了多重耐药．舒巴坦钠与β-内酰胺类抗生素联用能明显提高对产酶耐药菌的体外抗菌活性[5]．本试验结果表明，舒巴坦钠不仅能增强第三代头孢菌素类抗生素对产ESBLs鸡大肠杆菌的抗菌活性，而且能明显提高阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素的抗菌活性．其原因可能是舒巴坦钠本身对产ESBLs菌有一定的内在活性，或当用舒巴坦钠抑制ESBLs后，膜通透性改变，主动外排的作用亦相应减弱，从而在细菌细胞内的药物浓度增加，使这3种药物对产ESBLs鸡大肠杆菌的抗菌活性相应增强，其具体分子机制有待研究．

本试验结果表明，氟喹诺酮类、头孢噻肟、多西环素、氟苯尼考、阿米卡星、磷霉素加入EDTA后对产ESBLs鸡大肠杆菌的MIC降低，部分菌株可恢复敏感性．大多抗菌药物，如β-内酰胺类、氯霉素、磷霉素、氨基糖苷类药物，均主要通过大肠杆菌外膜蛋白（OmpF和OmpC，主要是OmpF）进入细胞内发挥抗菌作用[12]．文献[13]报道，EDTA作为一种常见的膜通透性促进剂，可以与维持细胞膜结构和功能的必需成分Ca2+、Mg2+等络合，从而导致细胞流动性和通透性增加，最终结果是增加药物进入细菌的浓度，以对抗外膜渗透性降低及药物外排泵出增强的多重耐药机制．文献[9]报道，在各抗菌药物中加入EDTA可治疗多重耐药细菌感染．在本试验中观察到，在抗菌药物中加入 EDTA使产ESBLs的多重耐药菌对多数抗菌药恢复了敏感性，说明EDTA与抗菌药联用，对控制多重耐药菌感染有应用价值．

本试验结果表明，第三代头孢菌素、阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素与舒巴坦钠+EDTA联用的MIC，均比与舒巴坦钠、EDTA联用的MIC有所下降．这表明，β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦钠与膜通透性促进剂EDTA联用，不仅对提高β-内酰胺环类药物的抗菌活性有协同作用，而且对提高阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素的抗菌活性有协同作用，从而进一步从表型上证明了特异性耐药机制产生 ESBLs与非特异性耐药机制膜通透性降低在产 ESBLs禽大肠杆菌多重耐药中有协同作用．据本试验结果推测，舒巴坦钠+EDTA与第三代头孢、阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素等联用，可能在产ESBLs多重耐药禽大肠杆菌的防治上有应用前景．

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英文编辑：罗文翠