鸡传染性法氏囊病病毒XX08株VP2高变区基因的克隆与序列分析*

岳 锋,宁红梅,银 梅,葛亚明,朱彦彩,周娟娟,贾文科,王文强,黄小东,王选年,4*

(1.河南科技学院,动物科学学院,河南新乡453003;2.双汇集团养殖部饲料厂,河南漯河462000;3.河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471003;4.新乡学院,河南新乡453003)

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(In fectious bursal disease virus,IBDV)引起鸡的一种高度接触性、免疫抑制性传染病。主要感染3月龄以内的青年鸡,给养鸡业造成巨大的经济损失[1-2]。IBDV基因组为双股RNA(dsRNA),由A和B两个片段组成,其中A片段包含两个部分重叠的开放阅读框(ORFs),小ORF编码17 ku的非结构蛋白VP5,大ORF编码110 ku的多聚蛋白NH 2-pVP2-VP4-VP3-COOH;而B片段编码VP1蛋白,具有RNA依赖于RNA聚合酶活性[3-7]。在IBDV的结构蛋白中,VP2和VP3是组成病毒核衣壳的主要蛋白成分,约占病毒蛋白成分的51%,VP2是宿主主要的保护性中和抗原,可以刺激机体产生中和抗体,其两个亲水区氨基酸212位～224位和氨基酸314位～324位是构成构象表位的重要组分,两个亲水区的氨基酸变化是毒株变异的主要因素[8-11]。

2008年河南新乡地区某养鸡场发生鸡传染性法氏囊病。主要临床症状表现为,发病初期鸡只精神沉郁、羽毛蓬松、啄肛,随着病情的发展,采食量逐渐下降,拉黄白色或绿色粪便,最后因脱水或衰竭而死,发病率在10%～35%之间,病死率为5%左右。病理剖检,鸡的腺胃和肌胃的交界处有出血点,大腿和胸部肌肉有刷状出血斑,法氏囊肿大,外包裹透明样胶冻状渗出物,黏膜皱褶上有出血点或出血斑,内有黄白色分泌物,肾脏有轻度的肿大和尿酸盐沉积,呈花斑样肾,盲肠扁桃体肿大出血。初步判定该鸡场发生鸡传染性法氏囊病。采取发病鸡的法氏囊,经琼脂扩散试验、病毒分离鉴定获得IBDV。本研究拟通过病毒基因的克隆与分析,进一步鉴定该病毒的生物学特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 IBDV XX08毒株,由河南科技学院动物科学学院病理学实验室分离并保存。

1.1.2 试剂 PCR试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司产品;AM V为Promega公司产品;Trizol为美国invitrogen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 参考Gen Bank中已发表的IBDV AY319768基因序列,用Primer premier 5软件设计一对特异性引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,预计扩增IBDV VP2高变区593 bp的片段。引物序列为:

1.2.2 病毒总RNA的提取 用Trizol法[12]提取病毒总RNA。

1.2.3 反转录 取制备的RNA11.5μL(100℃5m in预变性),Oligo(dT)1μL,dNTP 2.5μL混合,70℃作用5m in,然后于冰上加入5×buffer 5μL,RNA抑制剂5μL,AMV 1μL,DEPC水3μL,于42℃作用60min,合成cDNA第一条链。

1.2.4 PCR反应 反应体系:cDNA 2μL,10×bu ffer 2.5μL,M gCl2 21.5μL,dNTP 2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,Tag酶0.1μL,DDW 14.9μL。反应参数:94℃5 m in,然后进入40个循环:94℃1min,54℃1 min,72℃1 min;循环完毕后72℃继续延伸10min。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.5 PCR产物测序 PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.6 推导氨基酸序列分析 用DNA Star软件将测得的核苷酸序列转换成氨基酸序列,并进行氨基酸的同源性及遗传进化树的分析。

2 结果

2.1 RT-PCR产物

将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果出现593 bp的目的条带(图1)。然后进行大量扩增,鉴定正确后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序,测序结果见图2。

图1 鸡IBDV VP2高变区RT-PCR扩增产物Fig.1 RT-PCR amplification product of chicken IBDV VP2 gene highly variable region

图2 鸡IBDV XX08毒株VP2高变区cDNA序列及推导氨基酸序列Fig.2 The sequences of cDNA and deduction amino acids of chicken IBDV XX08 strain VP2 high ly variable region

2.2 推导氨基酸序列及遗传进化树分析

扩增核苷酸及推导氨基酸序列见图2,氨基酸序列与GenBank中鸡IBDV经典弱毒株D78(AF49992911)、欧洲超强毒株UK 661(CAA 63416)[13]、日本超强毒株OKYM(BAA 08555)[14]和经典毒株Cu-1(X 16107)比较见图3,XX 08毒株与超强毒株序列具有较高同源性。氨基酸序列同源性分析见图4,结果显示该毒株与超强毒株OKYM、UK 661和经典弱毒株D78的同源性均为96.8%,与经典毒株Cu-1的同源性为95.8%。各毒株的遗传进化树见图5,由图5可见XX08毒株与超强毒株OKYM和UK 661位于同一进化树。

图4 鸡IBDV XX08毒株氨基酸同源性分析Fig.4 Homology analysis of amino acids in chicken IBDVXX 08 strain

图5 鸡IBDV XX08毒株遗传进化树分析Fig.5 Phy logenetic analysis of chicken IBDV XX 08 strain

3 讨论

应用RT-PCR技术从分离毒株中扩增出593 bp(676-1269)VP2高变区,经测序、推导出的氨基酸序列与超强毒株和经典弱毒株进行比对分析和进化分析,XX08毒株VP2高变区与超强毒株和弱毒株的同源性均为96.8%,且与超强毒株位于同一进化树。

在IBDV VP2蛋白中222A、256I、294I和299S是vvIBDV的4个特征性氨基酸,此4个氨基酸使病毒局部的亲水性增强,导致毒力增加,222位的A被P代替可使IBDV毒力减弱;274N和284T是弱毒株的两个特征性氨基酸[15],并且此两个氨基酸的变化与IBDV的适应性有关。

鸡IBDV VP2是病毒的主要保护性抗原蛋白,刺激机体产生中和性抗体。VP2高变区(206Y-350T)是决定病毒毒力和抗原性的关键区域,包含2个亲水区(AA 212D-224G,AA 314T-324Q)和1个七肽区S-W-S-A-S-G-S(AA 326S-332S),2个亲水区参与病毒中和性抗原表位的形成,且不同毒株之间具有抗体交叉反应,说明两个亲水区的氨基酸序列比较保守。七肽区与病毒的毒力有关,其上的4个丝氨酸残基暴露在VP2蛋白外部,能与细胞膜形成分子间氢键,可能参与了病毒的黏附和成熟过程。本研究对XX 08毒株VP2高变区特征性氨基酸的分析显示,影响毒力的2个氨基酸279D和284A与超强毒株一致,在第一个亲水区222位的A被P替代,导致病毒的毒力减弱,vv IBDV的4个特征性氨基酸中,只有294I与其一致,而222P、256V和299N与经典弱毒株一致,9个特征性氨基酸212D、222P、256V、279D、284A、294I、299N、318G和322G中,除了222P、256V和299N与经典弱毒株一致外,其余的都与超强毒株一致。

通过以上对XX08毒株的氨基酸同源性和特征性氨基酸的分析,并结合临床症状,推测XX08毒株可能为中等强毒力毒株,为XX 08毒株的生物学特性的进一步研究奠定基础。

[1] 袁维峰,吴保明,张鑫宇,等.三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定[J].中国动物传染病学报,2009,17(1):29-32.

[2] Gao Y,Liu W,Gao H,et al.Effective inhibition of infectious bursal desease virus replication in vitro by DNA vector-based RNA interference[J].An tiviral Res,2008,79(2):89-94.

[3] 高玉龙,高宏雷,邓小芸,等.鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的原核表达与抗原性分析[J].中国生物制品学杂志,2006,19(2):143-145.

[4] 朱桂银,王旭东,朱建波.传染性法氏囊病毒基因组、蛋白和分子致病机理研究进展[J].云南农业大学学报,2007,22(3):448-451.

[5] Wei Y,Yu X,Zheng J,et al.Reassortant infectious bursal disease virus isolated in China[J].Virus Res,2008,131(2):279-282.

[6] 易道生,张 倩,李 楠,等.鸡传染性法氏囊病毒江苏地方株的分离及其VP2基因分析[J].畜牧与兽医,2008,40(10):63-67.

[7] Deng X Y,Gao Y L,Gao H L,et al.Iden tification of VP3 antigenic epitopes of infectious bursal desease virus[J].Bing Du Xue Bao,2007,23(4):305-311.

[8] Brand t M,Yao K,Liu M,et al.Molecular determ inan ts of virulence,cell tropism,and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus[J].JVirol,2001,75:11974-11982.

[9] Wang X N,Zhang G P,Zhou JY,et al.Identification of neutralizing epitopes on the VP2 protein of infectious bursal disease virus by phage-displayed heptapeptide library screening and synthetic pep tide mapping[J].Viral Immunol,2005,18:549-557.

[10] Cao Y C,Yeung W S,Law M,et al.Molecular characterization of seven chinese isolates of in fectiousbursal disease virus:classical,very virulent and variant strains[J].Avi Dis,1998,42:340-351.

[11] Letzel T,Cou libaly F,Rey F A,et al.Molecular and structural bases for the antigenicity of VP2 of infectious bu rsal disease virus[J].JVirol,2007,81:12827-12835.

[12] Jackwood D J,Kibenge F SB,Mercado CC,et al.The use of biotin-labeled cDNA probes for the detection of infectiousbursal disease viruses[J].Avi Dis,1990,34:129-136.

[13] Brown M D,Skinner M A.Coding sequences of bothgenomeseg ments of a European very virulent infectious burs al disease virus[J].V irus Res,1996,40:1-15.

[14] Yam aguchi T,Iwat a K,Kobayashi M.Epitope mapping of capsid proteins VP2 and VP3 of IBDV[J].Arch Virol,1996,41:1493-1507.

[15] Loon A A W M,Haas N D,Zeyda I,et al.Alteration of amino acids in VP2 of very virulent infectious bursal disease virus results in tissue culture adaptation and attenuation in chickens[J].JGen Virol,2002,83:121-129.