不同运动强度对男子赛艇运动员红细胞内皮型一氧化氮合酶的影响

黄红梅，屈金亭，刘 涛

内源性一氧化氮（NO)是由左旋精氨酸（L-A rg)在一氧化氮合成酶（NOS)的作用下产生的，是一种化学性质活跃的气体自由基，亦是一种重要的生物信号分子。在心血管系统中，NO具有扩张血管，抑制血小板黏附和聚集，抑制血管平滑肌细胞和淋巴细胞增殖，以及影响心脏舒缩周期和收缩力等功效[4]。大量研究表明，心血管系统NOSNO系统功能与机体运动形式、强度及持续时间密切相关[19]。NOS是调节NO合成的关键酶，已确认有3种同工酶：神经元型（nNOS)、内皮型（eNOS)和诱导型（iNOS)，它们分布的部位、生物效应及调控机制各不相同。研究表明，心血管系统NO主要是由血管内皮细胞中内皮型一氧化氮合成酶（eNOS)催化合成[17]。最近，Kleinbongard等发现，eNOS亦存在于红细胞浆膜，表明红细胞也是心血管系统内NO的主要来源之一[7]。本研究拟观察不同负荷运动对男子赛艇运动员红细胞eNOS蛋白表达量/活性和磷酸化水平，以及血浆中 NO含量的变化，以探讨红细胞eNOS-NO系统对于运动刺激的应答及可能机制。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

专业赛艇运动员10名（一级和健将级)，年龄21.6± 1.9岁，身高1.89±0.05 m，体重80.5±7.9 kg，训练年限5.8±1.9年。所有参加实验的运动员均身体健康，无器质性疾病，实验前48 h内受试者均未进行过剧烈运动。

1.2 测试方案

受试者于清晨（6：30～7：30)静卧15 min，空腹，肘静脉采血5mL。然后进行划船测功仪（CONCEPTⅡ，美国)递增负荷测试来测定受试者的 ˙VO2max，测试前以16桨/ min负荷做5min准备活动，准备活动后休息5min并佩戴好呼吸面罩，起始负荷为20桨/min，每3 min增加2桨，直至力竭。用运动心肺测试系统（Cortex MetaLyzerⅡ，德国)测定耗氧量（˙VO2)、CO2呼出量（VCO2)、呼吸交换律（RER =VCO 2/˙VO2)、每分通气量（VE)等，用遥测心率表（Polar A 3，芬兰)记录心率。受试者休息1周后，进行1次60％ ˙VO2max强度的运动（划船测功仪)，时间为20min，运动结束后即刻肘静脉采血5 mL；休息2天后，进行1次75％ ˙VO2max强度的运动，再休息2天，进行1次90％˙VO2max强度的运动，其运动方式、运动时间以及取血量与第1次相同。

1.3 红细胞的制备

所有血液样品均加入38 g/L枸橼酸钠（体积比1∶9)抗凝，1 400 g离心10 min，去上清。加入4倍体积 Hank’s平衡盐溶液（M HBSS)中反复离心3遍，清洗后取红细胞悬浮于等体积 Hank’s平衡盐溶液中待测。

1.4 红细胞eNOS活性及血浆NO-2/NO-3含量测定

依照试剂盒（南京建成生物公司)说明，紫外分光光度计测量红细胞 eNOS活性，自动生化分析仪测定血浆NO-2/NO-3含量。

1.5 红细胞eNOS蛋白总量及eNOS磷酸化水平测定

制备红细胞组织匀浆，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。蛋白样品经15％SDS-PAGE分离转移于PVDF膜。一抗（Santacruz公司)孵育过夜，HRP标记二抗（TBD公司)孵育1 h，ECL显影。采用凝胶系统分析软件（上海天能科技公司)，扫描各条带灰度值，以安静状态为100％，其他3组与安静时比值，即其相对表达量（％)。Actin作为内参蛋白。

1.6 统计方法

所有数据均用SPSS 15.0统计软件包进行处理，结果用平均数±标准差表示，各组比较采用单因素方差分析，P ＜0.05为显著性水平，P＜0.01为非常显著水平。

2 研究结果

2.1 不同运动强度对血浆NO-2/NO-3含量的影响

图1显示，与安静状态比较，运动强度为60％和75％ ˙VO2max时，血浆 NO-2/NO-3含量显著升高（均为 P＜ 0.05)，运动强度为90％˙VO2max时，血浆NO-2/NO-3含量显著降低（P＜0.05)。

2.2 不同负荷运动对红细胞eNOS活性的影响

图2显示，与安静状态比较，运动强度为60％和75％ ˙VO2max时，红细胞eNOS活性显著升高（分别为 P＜0.05和 P＜0.01)。运动强度为90％˙VO2max时，红细胞eNOS活性显著降低（P＜0.01)。

图1 不同运动强度对血浆NO2-/NO3-含量的影响示意图

图2 不同运动强度对红细胞eNOS活性的影响示意图

2.3 不同运动强度对红细胞eNOS蛋白总量及eNOS磷酸化水平

图3显示，与安静状态比较，运动强度为60％和75％ ˙VO2max时，红细胞eNOS蛋白总量和 Thr495磷酸化eNOS蛋白量无明显变化，Ser1177磷酸化eNOS蛋白量显著升高（分别为 P＜0.05和 P＜0.01)。运动强度为90％ ˙VO2max时，红细胞eNOS蛋白总量和Ser1177磷酸化eNOS蛋白量显著降低（均为 P＜0.05)，Thr495磷酸化eNOS蛋白量无明显变化。

图3 不同运动强度对红细胞eNOS蛋白总量及eNOS磷酸化水平的影响示意图

3 讨论

NO作为重要的信号分子，与运动关系十分密切。研究表明，运动过程中，血液中一定水平的NO可通过环鸟苷酸通路提高心肌和骨骼肌收缩力；可增加运动中组织氧摄入量和氧消耗量；可通过舒张血管调节运动中机体各器官血液重新分布；也可通过刺激 GLU-4转位促进组织葡萄糖转运等[10]。此外，NO还可通过调控红细胞变形性影响运动中红细胞的功能[8]。Sun等报道，大鼠运动前服用一定剂量L-A rg，可改善机体的运动能力，明显延长递增负荷运动的力竭时间，推迟疲劳发生[14]。而注射了NOS抑制剂N-硝基左旋精氨酸（L-NAM E)的人骨骼肌最大收缩速度及输出功率明显降低[6]。这表明，运动中维持一定水平的NO可正性调控机体运动能力。目前的研究主要关注于运动刺激血管内皮细胞以及骨骼肌产生NO的影响，最近发现，红细胞亦是心血管系统中NO的主要来源，这与定位于红细胞浆膜的eNOS密切相关[7]。研究表明，不同运动强度对红细胞膜流动性及脂质组成的作用效应不同[16]。因而，不同运动强度对红细胞eNOS功能及NO产生也会产生差异性作用，从而影响心血管系统中NO的稳态及生物效应。

本研究中，在运动强度为60％和75％˙VO2max时，红细胞eNOS活性显著升高，且随着运动强度的增加而增加，而eNOS总蛋白表达量无明显变化。当运动强度增加为90％˙VO2max时，红细胞eNOS蛋白表达量及活性均明显降低，甚至低于运动前安静状态时的水平。血浆NO含量的变化趋势与红细胞eNOS基本一致，提示运动过程中，红细胞产生的NO是血浆NO总量的重要组成部分。Rassaf等发现，前臂分别进行20％、30％和40％的最大握力强度运动，前臂静脉血浆中NO和血流量与运动强度呈正向的线性关系；而当强度增加至50％和60％时，上述指标与运动强度呈负相关线性关系[12]。Copp等报道，短期急性跑台训练可使大鼠后肢血管内皮细胞eNOS活性及血浆NO含量急剧增加，而力竭运动使上述指标显著降低，运动后恢复24 h仍然低于安静对照组[2]。我们认为，低强度和中等强度负荷运动可刺激红细胞等组织中eNOS表达量及活性升高，舒张血管，增加血流量，以代偿运动造成的组织血液供应相对不足；而当运动强度进一步增加时，eNOS-NO生物效应反而受到抑制，这可能与运动疲劳的形成相关。

运动可使血流加速，产生搏动性血流并增加血管内血流切应力，且血流切应力随着运动强度的增加而增加。研究证实，血流切应力是运动促血管内皮细胞释放NO的主要生理刺激。Fischer等在体外循环中发现，高血流切应力亦可显著激活红细胞中eNOS[3]。最近，Suhr等的研究表明，短暂的高血流切应力可增加红细胞eNOS的活性，而高频反复的高血流切应力反而会抑制 eNOS的活化[13]。Temiz等发现，在低水平血流切应力下，红细胞膜呈弹性固态，而在高水平切应力下，红细胞膜呈液态[15]。因而，不同运动强度可能通过影响改变血流切应力影响红细胞膜状态，从而动态调控位于红细胞浆膜eNOS的稳定性及活性。此外，Petibois等发现，大强度运动可加速红细胞膜蛋白质的脱失与降解[11]，这可能与90％˙VO2max强度运动造成的eNOS表达量快速减少有关。

除了蛋白表达量的变化，特定氨基酸的磷酸化也决定了eNOS的活性。eNOS主要有 3个磷酸化位点：Ser116、Thr495和 Ser1177，其中，Ser1177磷酸化使eNOS活性增强，而Ser116和 Thr495磷酸化则使eNOS活性减弱。本研究中，我们发现，60％和 75％˙VO2max的运动强度可使 eNOS （Ser1177)磷酸化水平增加，且随着运动强度增加而增加。而在运动强度为90％˙VO2max时，eNOS（Ser1177)磷酸化水平降低，eNOS（Thr495)磷酸化水平在各种运动强度中均维持于运动前安静状态水平。研究表明，血管中的血流切应力可以激活红细胞中磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K)-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt)信号通路，从而上调红细胞eNOS Ser1177磷酸化水平和NO产量[5]。因而我们推测，低强度和中等强度运动可能通过PI3 K-Akt通路上调eNOS Ser1177磷酸化水平，从而增加其活性和NO产量。而大强度运动导致的eNOS Ser1177磷酸化水平降低可能与红细胞eNOS蛋白总量减少有关，或有其他的抑制机制发生，其具体调控机制有待进一步研究。

4 结论

1.当运动强度适量时，红细胞eNOS蛋白表达、活化磷酸化水平以及NO产生随着运动强度增加而增加，可能是机体对运动应激的一种适应机制。

2.当运动强度过大时，红细胞eNOS蛋白表达、活化磷酸化水平以及NO产生受到抑制，可能与运动疲劳的发生相关。

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