定量测定铜绿假单孢菌发酵液中鼠李糖脂的方法学研究

齐香君， 徐婷婷

(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 前 言

本实验室为寻找高效的油脂降解菌，从餐厅油烟排出口附近筛选出一株油脂降解菌QZX-A，经鉴定该菌株为铜绿假单胞菌.在对QZX-A菌株研究的过程中，涉及到定量测定鼠李糖脂的量[1].目前定量测定鼠李糖脂方法不一，且即使采用同一测定方法但最大吸收波长不一，推测可能是发酵液中的其他不明成分对测定鼠李糖脂造成了干扰.针对这一现状，为了准确测定发酵液中的鼠李糖脂，本研究采用蒽酮硫酸法定量测定发酵液中的鼠李糖脂[2]，系统地研究了反应条件，并做了方法学考察.与其他蒽酮硫酸法不同的是，本研究在测定发酵液中的鼠李糖脂时采用的空白对照是未接种的发酵液，除了没有接种，其他成分都与发酵液严格一致.

1 仪器与试药

1.1 主要仪器设备

760CRT双光束紫外可见分光光度计，752型紫外分光光度计，FA2004上皿电子天平.

1.2 主要试剂药品

1.2.1 发酵液的制备

取铜绿假单胞菌QZX-B培养3 d的发酵液(培养基成分：KH2PO40.05%，K2HPO40.05%，(NH4)2SO40.1%，MgSO4·7H2O 0.01%，菜籽油1%，pH 8；培养条件：30 ℃，130 r/min，3 d).

1.2.2 标准品溶液的配制

称取干燥恒重的鼠李糖对照品8.6 mg,用水溶解,定容于100 mL量瓶中,配制成0.086 mg/mL的标准品溶液.

1.2.3 蒽酮试剂的配制

取蒽酮0.20 g溶于100 mL 85%的硫酸中.

1.2.4 测定方法[3]

精确取标准品溶液或发酵液1.0 mL置于试管中,于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮试剂4 mL,加完后混合均匀浸于沸水浴中, 15 min后取出,用自来水冷却,室温放置20 min.标准品溶液的空白以蒸馏水代替鼠李糖标准品,发酵液的空白对照以未接种的培养基代替发酵液，进行紫外检测或者扫描.

2 研究内容与方法

2.1 反应条件研究

采用1.2.4中测定方法，研究该方法中的最大吸收波长、水解时间、水解温度、蒽酮试剂加量、发酵液稀释倍数等内容.

2.2 方法学研究

采用2.1的研究结果，考察该方法的重复性、稳定性、精密度、回收率.

3 结果与讨论

3.1 实验条件的选择

3.1.1 验证鼠李糖脂的存在

比较图1和图2可以明显看出，图2在620 nm处的特征峰高度在原有基础上增加，峰形未发生变化，位置未发生偏移，因此可以确定发酵液中存在鼠李糖脂，且可以用测定鼠李糖的方法对鼠李糖脂定量检测.

图1 发酵液全波长扫描图 图2 发酵液添加鼠李糖标准品后的全波长扫描图

3.1.2最大吸收波长选择

由图3和图4可知，标准品和发酵液的共有特征吸收峰在620 nm处重合，所以取620 nm为最大吸收波长.图4采用未接种的发酵液作为空白对照，除了没有接种，其他成分都与发酵液严格一致.

图3 鼠李糖标准品波长扫描图 图4 发酵液波长扫描图

表1 不同水解时间的吸光度值(n=3),反应温度100 ℃

3.1.3 水解时间的选择

由表1可以看出，水解15 min的吸光度值最大，说明鼠李糖脂此时水解程度最高，因此选15 min为最适水解时间.时间多于15 min溶液颜色由蓝绿色变为棕红色，可能是水解时间过长，使发酵液中的其他成分发生了变化，影响显色，导致数据不稳定.

表2 不同水解温度下的吸光度值(n=3)，水解15 min

3.1.4 水解温度的选择

由表2可知，水解温度在80～100 ℃时吸光度值趋于稳定，100 ℃时吸光度值最大，因此选取100 ℃为最适水解温度.

3.1.5 蒽酮试剂加入量的选择

蒽酮试剂加入量为1 mL，2 mL，3 mL时，因为硫酸被稀释，蒽酮析出，溶液浑浊导致无法测量.加入量大于4 mL时，颜色偏黄棕色，可能是硫酸浓度过高，导致发酵液中其他成分碳化，影响检测.经紫外扫描，发现蒽酮加入量大于4 mL时，620 nm附近无特征吸收峰.因此选4 mL为最适加入量.

表3 不同蒽酮试剂加入量下的吸光度(n=3),水解时间15 min，反应温度100 ℃

3.1.6 标准曲线的绘制[4]

图5 鼠李糖标准曲线

精密吸取标准液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL于10 mL容量瓶中，加蒸馏水定溶摇匀，再分别吸取各浓度鼠李糖溶液1 mL，加人4 mL蒽酮试液，于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮试剂4 mL,加完后混合均匀浸于沸水浴中,自水浴重新煮沸起15 min后取出,用自来水冷却,室温放置20 min后以蒸馏水代替标准品溶液做对照，于620 nm处测定.

以鼠李糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，做回归处理[5]，得回归方程为y= 0.006x+0.003 3，相关系数R=0. 999 2,鼠李糖在浓度为8.6～60.2 mg/L范围内与吸光度值呈良好的线性关系.

3.1.7 发酵液样品中鼠李糖含量的测定

精密吸取适当稀释倍数的发酵液1 mL，于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮试剂4 mL,加完后混合均匀浸于沸水浴中,自水浴重新煮沸起15 min后取出,用自来水冷却,室温放置20 min后以未接种的发酵液做空白对照，于620 nm处测定.

表4 稳定性测定数据(n=3)

该批发酵液鼠李糖脂的产量为1 057.75 mg/L.

3.2 方法学考察

3.2.1 稳定性

取同一瓶样品溶液，按3.1.8方法操作，放置显色后每隔30 min测定1次,共测定5次，结果见表4，符合要求.

表5 重复性测定数据(n=3)

3.2.2 重复性

取同一批发酵液共5瓶，每瓶分别取样稀释，按3.1.8方法操作，测定其吸光度值，结果见表5，符合要求.

3.2.3 回收率试验

表6 回收率测定数据(n=3)

取已知浓度的样品溶液5份，分别加入一定量的鼠李糖标准品溶液，测定吸光度值.根据标准曲线换算成鼠李糖的浓度，计算回收率，结果见表6.

加标回收率达到99.98%，RSD=2.2%(n=5)，符合要求.

3.2.4 精密度

取同一瓶样品溶液，按3.1.8方法操作，重复测定5次,结果见表7.RSD=0.1%，精密度符合要求.

4 结论

(1)蒽酮硫酸法测定发酵液中鼠李糖脂的条件为：精密吸取稀释4倍的发酵液1 mL，于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮试剂4 mL,加完后混合均匀浸于沸水浴中,自水浴重新煮沸起15 min后取出,用自来水冷却,室温放置20 min后以未接种的发酵液代替接种后的发酵液做空白对照，于620 nm处测定.

蒽酮硫酸法测发酵液中的鼠李糖脂，反应条件与蒽酮硫酸法测糖的反应条件相同.本研究的创新点在于采用未接种的空白培养基代替待测样品中的发酵液作为空白，而不是采用蒸馏水做空白，优点在于能够消除其他物质的干扰.

表7 精密度测定数据(n=3)

(2)方法学考察稳定性、重复性、回收率、精密度合格.

(3)按照该方法测定发酵液中鼠李糖脂的量，得到的结果为1 057.75 mg/L.

因此采用本方法测定发酵液中鼠李糖脂，方法可靠可行.

参考文献

[1] 吴 虹,汪 薇,韩双艳.鼠李糖脂生物表面活性剂的研究进展[J].微生物学通报，2007，34(1)：47-50.

[2] 卢国满,刘红玉,曾光明, 等.鼠李糖脂快速定量分析方法及其影响因素研究[J]. 微生物学通报，2006，33(4)：106-111.

[3] Sim L,Ward O P,Li Z Y.Production and characterization of a biosurfactant isolated formPseudomonasaeruginosaUW-1[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,1997,19(4):232-238.

[4] ZHANG Wei-jie.Research of B of Glycoconjugates[M]. Hangzhou: Zhejiang University Press, 2003：297.

[5] 沙定国.误差分析与测量不确定度[M].北京:中国计量出版社, 2003:174-181.