替米沙坦对糖尿病模型鼠心肌微血管新生的促进作用

王小华,殷士良,赵玉萍,刘晓峰,赵春艳,周凤娟

（河北省唐山市滦县人民医院内分泌科 063700）

糖尿病心肌病变是糖尿病慢性并发症之一,独立于冠状动脉粥样硬化之外,是以微血管为主要病理改变的心肌病变[1-2]。AT1受体拮抗剂对心脏的保护作用已被公认,通过降低心肌中转化生长因子β1等对心肌纤维化起抑制作用,改善心室重构。而肝细胞生长因子（HGF）被认为是血管保护因子,目前越来越受到重视。AT1受体拮抗剂能否通过肝细胞生长因子对心肌微血管病变起改善作用,目前研究较少。作者通过建立2型糖尿病大鼠模型及替米沙坦干预作用,探讨A T1受体拮抗剂改善糖尿病心肌微血管病变的细胞因子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,体重（180±20）g,由实验动物研究中心提供。

1.1.2 试剂 链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,Sigma公司）、替米沙坦（美卡素,德国勃林格殷格翰公司）及兔抗大鼠多克隆HGF抗体（武汉博士德公司）等。

1.1.3 仪器 EIO-RAD电泳槽及电泳仪（美国RAD公司）、超薄切片机（LEICA EM UC6,德国LEICA公司）、透射电子显微镜（JEM-1200EX,日本）及心肌血管内皮细胞基底膜厚度观察采用电镜下MIAS-2000图像分析系统（四川大学图像图形研究所提供）等。

1.2 实验方法

1.2.1 2型糖尿病大鼠模型的复制 （1）高糖高脂饲料配方：熟猪油10%、蔗糖20%、胆酸盐1%、胆固醇2.5%、普通饲料66.5%。其中碳水化合物热卡占40%,脂肪热卡占42%,蛋白质热卡占18%；（2）链尿佐菌素（STZ）的配制：临用前10min新鲜配置。以0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 4.4）在冰浴中新鲜配制成10mg/mL STZ溶液,用无菌滤器过滤后放入事先准备好的无菌瓶内；（3）模型建立方法：高糖高脂饲料喂养4周后空腹15h,尾静脉一次性注射STZ 30mg/kg；（4）造模成功标准：注射STZ后3、7d测2次非禁食血糖大于或等于16.7mmol/L判断为2型糖尿病[3]；（5）排除标准：至少1次非禁食血糖小于16.7mmol/L者排除实验,以后每周测1次非禁食血糖,＜16.7mmol/L者及时排除。

1.2.2 实验分组 将40只SD大鼠随机分为正常对照组（C组）10只,给予常规饲料喂养；其余30只给予高糖高脂饲料喂养,分为糖尿病模型组（D组）15只,替米沙坦干预组（T组）15只。C组喂养4周后以按体重计算的枸橼酸盐尾静脉注射,D、T组给予STZ尾静脉注射；T组给予替米沙坦8.34mg·kg-1·d-1（相当于人80mg/d）溶于1mL水中灌胃,C、D组给予等体积生理盐水灌胃。各组大鼠继续原饲料喂养12周结束实验,见表1。

表1 大鼠分组情况

表2 各组大鼠生化指标及心肌细胞内HGF水平比较（±s）

表2 各组大鼠生化指标及心肌细胞内HGF水平比较（±s）

*：与C组比较,P＜0.01；#：与D组比较,P＜0.01。

组别 TG（mmol/L） T C（mmol/L） FBG（mmol/L） FINS（μ IU/mL） IRI HGF C组 0.73±0.05 1.93±0.06 4.66±0.57 20.34±2.06 1.43±0.15 1.00±0.00D组 1.65±0.07* 4.90±0.10* 20.17±1.25* 32.43±3.80* 3.36±0.16* 2.73±0.07*T组 1.29±0.051*# 4.74±0.15* 19.28±1.51* 25.69±3.17*# 3.0±0.11*# 3.59±0.09*#

1.2.3 血清生化指标检测 空腹12h测心功能后自颈动脉采血3mL,置于离心管中,3000r/min离心10min,吸出血清置于EP管中,-20℃冰箱中贮存,备测血糖、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、胰岛素等。（1）血糖：采用葡萄糖氧化酶法,由BECKM AN全自动生化分析仪自动检测。（2）TG：采用甘油磷酸氧化酶法,由BECKMAN全自动生化分析仪自动检测。（3）TC：采用酶比色法,由BECKM AN全自动生化分析仪自动检测。（4）血清胰岛素：采用放射免疫法,严格试剂盒说明书操作：①按顺序将总T管、NSB管、“0”管、各标准管、样品管摆放好；②分别向NSB管、“0”管内加入缓冲液200、100μ L；③向各标准管内加入Ins.标准品（S1-S6）100μ L；④向各样品管内加入各样品100μ L；⑤向每个管内加入125Ins.100μ L；⑥向“0”管、各标准管、样品管内加入Ins.抗体100μ L；⑦混匀,温育2h；⑧向除总 T管内的每个管内加入驴抗豚免疫分离剂500μ L；⑨充分摇匀后,室温放置15min,用KDC-2044低速冷冻离心机4000r/min离心15min；⑩吸弃上清液,用GC-911γ放射免疫计数仪测各沉淀管放射性计数。用log-logit数据处理模式联机处理,得出结果。批内变异系数为4.2%,批间变异系数为7.5%。（5）计算胰岛素抵抗指数（IRI）,IRI=ln（FBG×FISN/22.5）。

1.2.4 心肌中HGF水平检测 （1）样品总蛋白提取及浓度测定：用Western blot法测定 TGF-β1及HGF含量,参照《微生物法医学：理论与技术》的方法[4]。取左室心尖部心肌组织黄豆粒大小,用PBS缓冲液洗净,剪碎样本,加入RIPA buffer裂解液覆盖组织,用匀浆机匀浆,4℃,12000r/min离心25min,保留上清液,应用BCA法,酶标分析仪测定各样品吸光度,根据标准曲线计算出各样品总蛋白浓度；（2）2SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳：加NCIP/NBT显色后,各样品均加样50μ g蛋白,经10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转印至聚偏（二）氟乙烯（Polyvinylidene difluoride,PVDF）膜上,TBS（20mmol/L Tis-HCL,500MmNaCl,pH7.5）、1%BSA封闭2h，TBS洗膜3×5min,加入稀释的一抗兔抗大鼠HGF多克隆抗体（1∶400）和稀释的兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体（1∶400）,摇床上4℃杂交过夜。TTBS（含0.05%Tween-20的TBS）洗膜3×5min。倒掉洗膜液,分别加入与一抗相对应的1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗,摇床上杂交1h。取出 PVDF膜,TTBS洗膜2×5min；TBS洗膜 5min。加NCIP/NBT显色2～5min,待蛋白条带显示清晰时,终止反应,扫描。利用Gene Genius生物图像凝胶分析仪测定目的蛋白条带亮度,以β-actin作为内参照。并以对照组样品条带亮度为100%,计算出各样品的相对值作为各蛋白质的相对表达量。本实验重复3次。

1.2.5 心肌超微结构观察 取左心室心尖部位心肌组织用3%戊二醛和1%锇酸固定,乙醇逐级脱水,丙酮浸透,环氧树脂包埋,切成1μ m半薄切片,用醋酸铀初染,枸橼酸铅复染,于电子显微镜下观察不同组同一部位心肌微血管的超微结构变化,并测定心脏细胞表面积及毛细血管细胞基底膜厚度。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行分析。所有数据以±s表示,多组间采用单因素方差分析One-way Anova,两两比较用LSD检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 替米沙坦对糖尿病大鼠生化指标及心肌细胞内HGF水平的影响 与C组比较,D、T组空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、胰岛素抵抗指数（IRI）、TC、TG、HGF蛋白含量均升高；与D组比较,T组FINS、IRI、TG均降低,差异有统计学意义,FBG、TC差异无统计学意义,HGF蛋白含量明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）,见表2。

2.2 电镜下心肌病理学改变 C组毛细血管内皮细胞扁平光滑,管腔不狭窄,基底膜正常。D组毛细血管内皮细胞核肿胀向管腔突出,血管壁内膜凹凸不平,管腔狭窄,基底膜增厚,断裂模糊。T组毛细血管内皮细胞核轻度肿胀,管腔狭窄较D组轻,基底膜较清晰,无断裂。与C组比较,D、T组心肌细胞表面积和心脏血管细胞基底膜厚度增加,与D组比较,T组心肌细胞表面积和心脏血管细胞基底膜厚度减少,且差异均有统计学统计学意义,见表3。

表3 各组心肌病理学改变（±s）

表3 各组心肌病理学改变（±s）

*：与C组比较,P＜0.05；#：与D组比较,P＜0.05。

组别 心脏细胞表面积 心脏血管细胞基底膜厚度C组 343.30±36.63 3.63±0.45D组 474.88±49.39* 5.19±0.48*T组 421.77±33.47*# 4.62±0.43*#

3 讨论

2型糖尿病模型制备比较常见的是高糖高脂饮食或高脂饮食加以小剂量STZ腹腔或尾静脉注射[2]。通过饮食造成高脂高胰岛素血症,然后注射小剂量STZ破坏胰岛β细胞功能,使其发生高血糖,类似于2型糖尿病发病过程。本实验参照招少枫等[3]的方法先给予高糖高脂饮食 4周,然后给予 STZ 30mg/kg尾静脉一次性注射,经STZ注射后1周末测体重和血糖,D、T组明显高于C组,成功建立了2型糖尿病SD大鼠模型。STZ是一种抗癌药物,15～40mg/kg STZ对正常大鼠胰岛功能破坏小,一般不造成血糖升高。实验中给予 STZ 30mg/kg尾静脉一次性注射,较腹腔注射稳定,成模总有效率为73.3%。本实验每周检测血糖1次,随时排除血糖不符合标准者,保证血糖直到实验末达到糖尿病标准。实验结束时空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数、TC、TG等指标D、T组与C组比较均有明显差异,符合高糖、高脂、高胰岛素血症的2型糖尿病标准。

糖尿病心肌病变主要以微血管病变为主,其发病机制目前仍不十分清楚,可能与心肌细胞能量代谢紊乱、细胞功能改变、凋亡增加、细胞因子的异常表达有关。心肌细胞内葡萄糖的摄取及氧化障碍导致脂肪酸氧化增加,其代谢产物积聚引起细胞内酶系统活性抑制。由于长期代谢紊乱,血液动力学、血液流变学等方面的改变引起心肌微血管病变。心肌微血管管壁增厚,管腔狭窄,心肌可发生广泛的缺血、变性、坏死和纤维化等。本研究结果显示毛细血管基底膜增厚、管腔狭窄、心肌细胞肿胀均是心肌细胞代谢障碍的结果,与文献报道一致[5]。

近年来HGF对心血管的保护作用已倍受关注。HGF在肝脏大量合成,并分泌入血液循环中。HGF在许多靶器官包括心脏和血管中具有多种生物学作用,能促进细胞分裂、迁移以及形态的发生,是形成、维持及重塑多细胞组织结构的重要血管营养因子。本研究结果显示替米沙坦增加心肌中HGF表达,这与Nakano等[6]研究发现利用血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体-1阻断剂治疗6周后,心脏、血管局部HGF含量明显上升的结果一致。

替米沙坦是一种新型的AT1受体拮抗剂,其对心肌微血管结构的保护作用可能与下列机制有关：（1）选择性激动PPARγ。有研究表明替米沙坦能在治疗剂量下选择性激动PPARγ[7]。当PPARγ被激活后脂联素（APN）表达则明显增加；同时血管紧张素受体阻滞剂（ARBs）还能抑制细胞内APN降解,使 APN含量增加,从而起到调节代谢、改善胰岛素抵抗、增加胰岛素敏感性的作用,减少由于代谢紊乱对心肌结构的损害。同时发现可以通过PPARγ途径下调A T1表达,进一步对心肌起保护作用[8]。（2）升高心肌中HGF表达。有研究显示AT1受体拮抗剂可降低心肌局部AgⅡ表达[9],而AgⅡ为HGF抑制剂,从而升高心肌中HGF表达。本研究结果显示替米沙坦升高心肌中 HGF表达,与文献报道一致[10]。HGF通过抗凋亡、促血管新生、修复内皮细胞等对心肌具有保护作用。其机制可能与 HGF负向调节转化生长因子-β1（TGF-β1）和AgⅡ有关。总之,替米沙坦能够改善糖尿病心肌超微结构,可能与升高心肌中HGF表达有关。进一步研究如何升高心肌中 HGF表达将成为治疗糖尿病心肌病变的新思路。

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