新生牛睾丸细胞的分离纯化与冷冻保存

郑 鹏，李冬旭，田亚光，黄 贺，张贵学

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

自1994年Brinter和Eimmerman报道将可育小鼠的精原干细胞移植到不育小鼠的睾丸中并建立了精子以来，精原干细胞成为干细胞研究领域的又一个研究热点[1]。精原干细胞技术的发展和应用，将会为克隆动物、濒危动物保种、转基因动物的生产、治疗雄性不育及一些人类遗传疾病的基因治疗提供新的机遇与途径。一些实验室分别对新生鼠[2]、幼鼠[3－4]、成年鼠[5]、成年人[6]、幼年山羊[7]、新生猪与幼年猪[8－9]、3～7月龄牛[10]的精原干细胞进行了分离纯化、体外培养、移植等相关研究，而对新生牛精原干细胞的研究报道很少。为此，本研究以新生牛作为实验动物，对睾丸生精上皮细胞进行分离纯化与冷冻保存，以期为牛精原干细胞的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物与药品

新生牛睾丸（2 h内送回实验室）；试验试剂除DMEM/F－12、FBS购自Gibco公司外，其他无特殊说明外均购自Sigma公司；试验所用抗体无特殊说明外均购自Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 睾丸组织学观察

取睾丸组织小块，放入pH 7.2的2.5%戊二醛固定液中固定，进行电镜切片的制作和观察。

1.2.2 新生牛睾丸生精上皮细胞悬液的制备

将睾丸组织在PBS中拨散，获得曲精细管小段。用含有 0.15%胶原酶Ⅳ及 10 μg·mL－1DNaseⅠ的消化液在室温条件下消化5～10 min，期间吹打2～3 次，600 r·min－1离心 5 min 去除消化液，重复上述消化1次。然后用0.25%胰酶室温消化，期间不断吹打，待悬液中看不到曲细精管时加入等量的基础培养液（DMEM/F－12+10%FBS+1%双抗）终止消化，100 μm滤网过滤，将过滤后的细胞悬液以1 000 r·min－1离心10 min去除上清液，将细胞沉淀重新以基础培养液悬起并制作细胞涂片，进行AKP染色（北京中杉金桥）。

1.2.3 差速贴壁分选细胞

将生精上皮细胞悬液以（1～5）×106个·mL－1接种到培养瓶中培养2～4 h，用吸管轻轻吹打，悬起尚未紧密贴壁的生精细胞和部分支持细胞，转移到新的培养瓶中，培养过夜，然后用吸管吹打悬起生精细胞，细胞悬液经1 000 r·min－1离心5 min，弃上清，用培养液重悬细胞。分选前后，进行AKP染色鉴定分离纯化效果。

将差速贴壁分选后的细胞制作细胞涂片。进行兔抗人 C－kit抗体（1∶300，北京中杉金桥）、羊抗OCT－4多克隆抗体（1∶500）免疫组化染色。

1.2.4 精原干细胞的冷冻保存

将曲细精管剪成小段，按照阶段降温法（4℃，1 h；－20℃，1 h；－80℃过夜）进行冷冻保存。冷冻液分别是基础培养液加上含量为5%、10%、15%的二甲基亚砜、乙二醇、甘油。复苏后，消化成单细胞悬液，台盼蓝染色检测细胞活力。

1.2.5 支持细胞的分离纯化与鉴定

按照精原干细胞分离纯化的步骤，培养2～4 h后，用吸管轻轻吹打，更换新鲜基础培养液培养过夜，用胰酶消化后重新接种，培养24 h后，进行HE染色、油红O染色、波形蛋白（Vimentin）免疫组化染色。

1.2.6 支持细胞的冷冻保存

选取状态良好的第三代支持细胞按照阶段降温法进行冷冻保存。冷冻液分别是基础培养液加上含量为10%的二甲基亚砜、乙二醇，然后在两种基本冷冻液中分别添加 0.1 mmol·L－1、0.2 mmol·L－1的蔗糖、海藻糖。

1.3 统计分析

用SPSS13.0软件进行统计分析，P＜0.05为差异具有显著性意义，数据表示为±S。

2 结果与分析

2.1 组织学观察

新生牛睾丸的曲细精管由附于基膜外的肌样细胞、基膜、基膜所包围的支持细胞和精原干细胞组成。支持细胞紧贴基膜（见图1），形态多样，有圆形、锥形和柱状，细胞直径约15 μm，胞质着色较深，细胞核的形状随细胞形状的不同而各异，1～3个核仁，位置不固定，在核质中和核内膜都有分布。精原干细胞根据直径可分为两种类型，一种是直径约15～20 μm的大精原细胞，另一种是直径约10～15 μm的小精原细胞，精原干细胞细胞质染色较浅，细胞核较大，圆形，1～2个核仁。精原干细胞有的附在基膜上（见图1A），有的位于管腔中央（见图1B）。在曲细精管之间是睾丸间质细胞和毛细血管。

图1 睾丸曲细精管横切Fig.1 Cross sections of seminiferous tubules

2.2 精原干细胞的分离纯化与鉴定

睾丸组织经过第一次消化和低速离心洗涤，已基本除去了睾丸间质细胞，所获得的睾丸组织样品主要是曲细精管；再经过消化、过滤和离心洗涤后，既除去了未消化完全的组织块，也进一步除去了睾丸间质细胞和细胞碎片，所获睾丸细胞悬液中主要有精原干细胞和支持细胞。AKP染色显示，有少量的细胞是阳性的，初步判断是精原干细胞（见图2A）。

差速贴壁分选前后，通过AKP染色进行验证分析，结果显示分选前培养物中只有极少数细胞是阳性的，分选后培养物中大多数细胞是阳性的，细胞阳性率为72%（见表1）。对分选后的精原干细胞进行免疫组化分析，结果C－kit（见图2B）、OCT－4（见图2C）均呈阳性。

2.3 精原干细胞的冷冻保存

由表2可知，三种冷冻液中，以二甲基亚砜为冷冻剂的效果最好，二甲基亚砜的适合添加浓度为10%。

图2 精原干细胞鉴定Fig.2 Identification of spermatogonial stem cells

表1 精原干细胞的差速贴壁分选（n=10）Table 1 Differential adherent spermatogonial stem cells selection（n=10）(%)

表2 精原干细胞在三种冷冻液中的细胞复苏率（n=10）Table 2 Spermatogonia stem cell survival rate with three cryoprotectants（n=10）(%)

2.4 支持细胞分离纯化与鉴定

生精细胞悬液培养2～4 h后，更换新鲜培养液后观察，可见贴壁细胞已经极化、胞体伸展、形态不规则，初步判定是支持细胞。继续培养过夜。HE染色：支持细胞形态不规则，胞质完全铺开，染色较淡，而细胞核染色较深，呈圆形或椭圆形位于细胞质中央或偏位，核仁明显（见图3A）。油红O染色可使支持细胞核周围分布的许多圆形或卵圆形的脂质小滴呈红色或红褐色，而细胞其他部分不着色（见图3B）。在睾丸曲细精管中，波形蛋白特异地表达于支持细胞，免疫组化染色显示培养的细胞表达波形蛋白（见图3C）。

图3 支持细胞染色Fig.3 Sertoli cells staining

2.5 支持细胞冷冻保存

由表3可以看出：添加海藻糖能显著提高冷冻效果，10%乙二醇和0.1 mmol·L-1海藻糖组合是最佳的冷冻保护剂。

表3 支持细胞在不同冷冻保护剂中的复苏率（n=5）Table 3 Sertoli cells survival rate with some cryoprotectants（n=5）

3 讨论与结论

3.1 组织学观察

原始生殖细胞迁移到生殖嵴并转化为性原细胞，性原细胞进行短时间的有丝分裂增殖，然后停止在G0/G1期，小鼠出生后不久，性原细胞恢复分裂活动并向基膜迁移，第6天左右到达基膜转化为精原干细胞，即As型精原细胞[11]。试验中观察到性原细胞已向基膜迁移，性原细胞何时恢复分裂活动、何时到达基膜，目前还不是很清楚，Wrobel等认为至少需要25周的时间[12]。大精原细胞和小精原细胞是否具有不同的发育命运，有待于进一步的研究，Wrobel等认为小精原细胞与大精原细胞相比很少分化[12]。Izadyar等证实几乎全部的大精原细胞都表现出C-kit阳性，而很少有小精原细胞表现出C-kit阳性[10]。

3.2 精原干细胞与支持细胞的分离纯化

生精细胞悬液中常常并不能完全彻底地分离出目的细胞，只能达到培养物中以某种细胞为主的程度，所以也常称为富集（Enrichment）。分离纯化的方法主要有：不连续Percoll密度梯度离心法[8-10]、差速贴壁分选法[2]、盘化法[7]、流式细胞分选法[2,4,11]以及免疫磁珠分离法[4,6]等。本试验通过酶消化法结合差速贴壁分选法使精原干细胞的纯度达到72%，可见，差速贴壁法分选法更简单、可行。

3.3 精原干细胞与支持细胞的冷冻

在冷冻过程中，海藻糖有助于稳定细胞膜和蛋白质，具有良好的玻璃化形成能力[13]。乙二醇被认为是高效低毒的渗透性保护剂，近年来广泛应用于哺乳动物胚胎、人胚胎干细胞的冷冻中[14]，本试验主要探讨了用低毒的乙二醇代替二甲基亚砜、添加蔗糖和海藻糖是否可行，试验证实，精原干细胞冷冻保存，以10%的二甲基亚砜为冷冻剂的效果最好；支持细胞冷冻保存，以10%乙二醇和0.1 mmol·L-1海藻糖组合作为冷冻保护剂的效果最好。

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