奶牛乳腺发育与泌乳过程中能量代谢的变化

任立杰，佟慧丽，李庆章，高学军

（乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

谢规律可以为调节奶牛乳腺发育能量负平衡，提高奶牛生产性能提供重要的理论基础。一般对奶牛能量代谢的研究往往停留于脂肪酸、氨基酸等物质的营养调控与奶牛乳腺发育泌乳能量代谢水

能量是高产奶牛发挥泌乳潜力的重要因素，能量摄入量不足是影响高产奶牛泌乳量和乳品质的因素之一，特别是高产奶牛泌乳初期，能量代谢往往处于负平衡。研究奶牛乳腺发育的能量代平的关系[1-3]。目前，一些研究者对小鼠不同发育时期乳腺组织中的能量代谢相关酶的表达变化进行了系统的测定[4-5]。Rudolph等同时对乳腺中一些酶作用的底物如α-和β-型的葡萄糖、乳糖、半乳糖浓度进行了测定[5]。糖和脂肪是重要的能源物质，其中三羧酸循环、糖异生、糖酵解、磷酸戊糖途径及脂肪酸氧化等代谢途径与能量代谢有密切关系。而代谢途径中的酶作为生物反应的催化剂，其相对数量决定代谢反应的进程和方向，对代谢过程具有重要的调节作用。本研究旨在通过对奶牛乳腺各个发育时期重要代谢途径的关键酶及重要代谢产物的系统研究揭示奶牛乳腺发育与泌乳能量代谢的规律，为奶牛泌乳调控技术提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用乳腺组织来自澳洲进口健康荷斯坦奶牛，饲养于东北农业大学畜牧高新技术园区。根据奶牛乳腺发育的特点，分别在青春期2个月（V2M）、12个月（V12M）、14个月（V14M）；妊娠期2个月（P2M）、4个月（P4M）、6个月（P6M）；围产前期（WC）；泌乳期 7 d（L7 d）、50 d（L50 d）、140 d（L140 d）、280 d（L280 d）、退化期 3 d（I3 d）、30 d（I30 d）4个时期共设立13个取样点各剖杀1头奶牛取乳腺组织，乳腺组织采集后，DEPC水冲洗，迅速转入DEPC处理过的冻存管中，液氮冻存后转入-80℃冰箱备用。

1.2 试剂

己糖激酶（Hexokinase，HK）测试盒（南京建成）；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-Phosphatase Dehydrogenase，G-6-PD）活性终点比色法定量检测试剂盒（上海杰美）；异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate Dehydrogenase，ICDH）活性检测试剂盒（上海杰美）；葡萄糖（Glucose，Glu）测定试剂盒（南京建成）；乳糖（Lactose，LAC）标准品购自天津军事医学科学院；ATP酶测定试剂盒（南京建成）；甘油三酯（Triglyceride，TG）测定试剂盒（南京建成）；牛β-酪蛋白（β-casein）标准品（Sigma）；其他常规实验药品及试剂为国产分析纯。

1.3 设备

ZHJH-1112垂直流超净工作台；上海智城分析仪器制造有限公司；LC-10AT高效液相色谱仪，日本岛津；2695-2996型HPLC色谱仪，美国Waters；Delta-600-2487制备型HPLC色谱仪，美国Waters；SBA系列生化分析仪，赛诺迈德医学技术有限责任公司；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂。

1.4 方法

HK、G-6-PDH、ICDH、ATP酶活性、葡萄糖及TG的测定方法遵照试剂盒说明书进行，试验中每个指标做3次重复，下同。

HPLC法测定乳糖的分泌情况方法参见文献[6]；

HPLC法测定β-酪蛋白的分泌情况方法参见文献[7]；

能荷、NADPH的测定方法参见文献[8]。

1.5 结果统计

采用SigmaPlot 9.0软件对相关试验数据进行统计分析，并采用Excel软件对统计分析后的试验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶活性的检测结果

己糖激酶活性在各个时期变化量不明显，在退化期30 d时达到最高，在妊娠2个月时最低；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶表达活性在各个时期变化量较明显，在泌乳7 d时最高，在妊娠2个月时最低；异柠檬酸脱氢酶活性在各个时期变化量较明显，在泌乳7 d时最高，在妊娠4个月时最低（见图1～3）。

图1 己糖激酶（HK）活性检测结果Fig.1 Detection results of HK activity

图2 异柠檬酸脱氢酶（ICDH）活性检测结果Fig.2 Detection results of ICDH activity

图3 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)活性检测结果Fig.3 Detection results of G-6-PD activity

2.2 甘油三酯、葡萄糖、乳糖及β-酪蛋白含量的检测结果

结果见图 4～7。

图4 甘油三酯（TG）含量检测结果Fig.4 Detection results of TG content assay

甘油三酯含量在各个时期变化量不明显，在围产前期达到最高，在妊娠2个月时最低；葡萄糖含量在各个时期变化量较明显，在青春期14个月时最高，在妊娠期2个月时最低；乳糖含量在各个时期变化量较明显，在围产前期达到最高，在青春期2个月时最低；β-酪蛋白含量在各个时期变化量较明显，在退化3 d时达最高，在青春期2个月时最低。

图5 葡萄糖（Glu）含量检测结果Fig.5 Detection results of Glu content assay

图6 乳糖（LAC）含量检测结果Fig.6 Detection results of LAC content

图7 酪蛋白（β-casein）含量检测结果Fig.7 Detection results of β-casein content

2.3 ATP酶活性的检测结果

Na+K+-ATP酶活性在各个时期变化量不明显，在泌乳280 d时最高，在妊娠2个月时最低；Ca2+Mg2+-ATP酶活性在各个时期变化量不明显，在泌乳140 d最高，在青春期2个月时最低（见图8）。

图8 ATP酶活性检测结果Fig.8 Detection results of ATPase activity

2.4 能荷值和NADPH含量的检测结果

组织能荷值在各个时期变化量不明显，在围产前期最高，在泌乳140 d时最低；NADPH含量在各个时期变化量不明显，在妊娠4个月时最高，在青春期14个月时最低（见图9、10）。

图9 能荷含量检测结果Fig.9 Detection results of Energy charge content

图10 NADPH含量检测结果Fig.10 Detection results of NADPH content

3 讨论

3.1 青春期奶牛乳腺能量代谢变化规律

青春期乳腺导管和腺泡上皮细胞较少，主要为不规则的脂肪和结缔组织。此时期乳腺组织发育较慢，能量代谢并不旺盛，因此目前还没有对青春期奶牛乳腺能量代谢规律的系统研究。本研究通过对乳腺发育青春2个月、青春12个月至青春14个月这一阶段的研究结果发现，三羧酸循环的关键酶ICDH的活性在这一阶段没有显著变化，而糖酵解途径的关键酶HK和磷酸戊糖途径的关键酶G-6-PD的活性呈现出增长的趋势，结合青春期阶段奶牛乳腺组织中的葡萄糖浓度高于妊娠期和泌乳期，推测可能与其作为相对单一的糖代谢主要物质有关，也可能是与其代谢消耗较少有关。

3.2 妊娠期奶牛乳腺能量代谢变化规律

妊娠期乳腺进一步发育，妊娠中期，合成乳糖和乳脂所需的酶开始出现[9]，妊娠晚期，在组织结构上接近于泌乳的乳腺。大量研究表明，妊娠期的乳腺发育决定了泌乳期分泌细胞的数量和后续的产乳能力[10]。NADPH常常存在于糖类代谢过程中。结果显示P4M的NADPH最高，这可能是与乳腺快速发育所需的生物还原力有关。此时期物质和能量代谢逐渐旺盛。这与周贵等的报道相一致[11]。

3.3 围产前期奶牛乳腺能量代谢变化规律

围产期是奶牛整个的泌乳周期中最至关重要的一个时期，在这个阶段，奶牛经历了巨大的生理与代谢变化，抵抗力较差，故发病率要比泌乳中、后期均高，此时期奶牛亦需要大量能量。此时期甘油三酯、乳糖浓度和能荷较高。能荷是动态调节细胞能量平衡的一个参数[12]，也是含高能磷酸键的腺苷的比值，其作为测定细胞高能磷酸状态的指标，可有效评估组织细胞的能量储备状态。此时其脂肪动员减弱，这与张光军的报道相一致[13]，而本试验亦测得此时期甘油三酯浓度较高。这一时期主要进行物质和能量贮备。能量贮备和摄食的调节与脂肪状态调节食欲的理论相一致[14]，表明在奶牛的围产期，能量的储备与防止产后能量负平衡有密切关系。另有研究表明，围产期增加能量摄入，对奶牛健康、泌乳及高产奶牛的再生产性能有积极作用[15]。

3.4 泌乳期奶牛乳腺能量代谢变化规律

泌乳期乳腺的发育达到顶峰，泌乳初期ICDH活性和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性较高，说明此时期代谢旺盛，主要进行磷酸戊糖途径和三羧酸循环，提示泌乳期补充磷酸戊糖途径和三羧酸循环途径底物如葡萄糖等糖类物质及脂类等物质的重要性。这与刘国文等报道的高产奶牛在泌乳前几周常存在能量负平衡[16]，此时母牛处于酮病和脂肪肝的危险期相一致，随着泌乳期的延长，能荷和ICDH活性降低，供能分解代谢能力下降。提示应加强能量基础物质补充。

3.5 退化期奶牛乳腺能量代谢变化规律

断乳后，乳腺便停止分泌活动，进入退化期，腺泡上皮细胞开始凋亡。Mazurek等研究了小鼠乳腺退化时期的能量代谢情况，结果发现磷酸戊糖和糖异生途径的酶活性在乳腺组织退化的前期降低，同时 ATP、GTP、UTP、ADP、NAD、NADH和乳酸含量减少[4]。而糖酵解途径的关键酶磷酸果糖激酶在乳腺退化的前期其活性仍保持较高的水平。本研究对奶牛乳腺退化初期代谢途径的关激酶活性进行了检测，结果发现HK作为糖酵解途径的另一个关键酶，其在奶牛乳腺退化期高活性水平与小鼠乳腺的研究结果具有相似性，推测其可能与这一时期乳腺组织重建对分解代谢的能量与物质需求有关。

4 结论

本研究对乳腺组织中己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、甘油三酯、葡萄糖、乳糖、β-酪蛋白、ATP酶、能荷值和NADPH等指标进行了测定。结果表明，青春期14个月时葡萄糖浓度最高，妊娠4个月时NADPH含量最高，围产前期时甘油三酯含量、乳糖含量和能荷值最高，泌乳7 d时异柠檬酸脱氢酶活性和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性最高，泌乳140 d时的Ca2+Mg2+-ATP酶的活性最高，泌乳280 d时的Na+K+-ATP酶活性最高，退化期3 d β-酪蛋白含量最高，退化期30 d时的己糖激酶活性最高。从而揭示了奶牛乳腺不同发育时期能量代谢的规律。

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