O139,142,26混合血清型大肠杆菌的O-抗原基因簇的破译

许亚卓，杨春柳，刘文鑫，杨旭东，李海滨，师东方

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

大肠杆菌的不同血清型分类是由大肠杆菌O-抗原决定的。大肠杆菌O-抗原是大肠杆菌细胞最外侧结构，由多个重复的单糖单位组成，是构成大肠杆菌脂多糖的重要组成部分[1]。其单糖种类、数量以及单糖间键，寡糖单位之间键的不同构成了O-抗原的多样性，根据O-抗原进行分类，大肠杆菌现已有180多种不同血清型[2-4]。O-抗原种类虽多，但都有固定结构模式，O-抗原基因一般分成三部分：单糖合成酶基因；糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。这些结构基因都位于galF和gnd 2个看家基因之间。galF基因和gnd基因分别位于O-抗原基因簇的5′末端和3′末端，它们不属于O-抗原基因簇[5]。这两个看家基因在不同血清型大肠杆菌中都有相对保守的部分，比较稳定，可用来扩增O-抗原基因簇[3]。

师东方等从猪水肿病病死猪肠系膜淋巴结中分离到了一株O139,142,26混合血清型大肠杆菌[6]，这与以往的研究中曾发现过血清型交叉反应现象相符，Lothar等发现大肠杆菌O123的两个H型分别与O4、O12发生交叉血清型反应[7]，O142与O106在发生了一个羧基改变后也发生了交叉血清型反应现象[8]，在牦牛体内[9]和试验兔体内[10]分离到混合血清型大肠杆菌，出现2个或3个血清型交叉反应，以及其他菌属与大肠杆菌之间都发生过血清型交叉反应现象[11]。本文通过鸟枪法扩增了O139,142,26混合血清型大肠杆菌分离株O-抗原基因，利用分子生物学软件对其O-抗原基因簇进行分析，为进一步研究混合血清型大肠杆菌分子生物学特性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

O139,142,26混合血清型大肠杆菌，大肠杆菌TGⅠ由本实验室保存。

1.1.2 质粒和试剂

PMD18-T Vector、PCR纯化试剂盒购自Sigma公司、HiFiPCR酶、EasyTaq酶、dNTP购自北京全氏金公司；Eco R I、DNaseI购自日本TaKaRa公司；引物由上海生工生物技术公司合成；氨苄青霉素、氯仿、异戊醇、乙醚、醋酸钠等常规试剂购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 O-抗原基因簇的获得

根据galF基因设计上游引物P1：5′ATTGTG GCTGCAGGGATCAAAGAAAT 3′，根据gnd基因设计下游引物P2：5′TAGTCGCGTGNGCCTGGATTA AGTTCGC 3′。提取该大肠杆菌基因组DNA做为模板[1]，用长距离PCR方法扩增O-抗原基因簇。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，70℃延伸10 min，30个循环，终延伸为70℃，7 min，反应体系为50 μL。合并8管PCR产物，用PCR纯化试剂盒纯化。

1.2.2 O-抗原基因文库的构建

用DNaseI消化PCR纯化产物，1∶8 000稀释DNaseI，在10 μL体系中加入7 μL PCR纯化产物，1 μL 0.5 mol·L-1Tris-HCl（pH=7.5）、1 μL MnCl2（0.1 mol·L-1），反应 10 min，用 1 μL 5 mol·L-1EDTA，在65℃终止反应。使其酶切片段在500～3 000 bp之间，合并反应产物，用氯仿∶异戊醇和醋酸钠对酶切产物进行纯化。用PCR方法对酶切片段补平加A，再经氯仿∶异戊醇和乙醚纯化，产物与pMD18-T载体在16℃连接24 h，取连接产物转化感受态大肠杆菌TGⅠ，涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，以碱裂解法大规模提质粒，用Eco RⅠ酶切鉴定其中的插入片段的大小，挑选插入片段在500～3 000 bp的克隆。为了保证序列的准确性，避免PCR反应本身的错配，根据帕松公式（P=e-m，P-未测定碱基的概率；m-测定序列的覆盖率）[12]，挑取了50个插入片段为500～3 000 bp的克隆进行测序拼接，使每个碱基至少有3个以上高质量（＞90%）的序列覆盖，最终得到全基因序列。

2 结果与分析

2.1 O-抗原基因簇的获得

根据galF和gnd基因设计上下游引物，用长PCR方法扩增O-抗原基因簇。长PCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，在接近15 kb的位置出现一条电泳带。将PCR产物酶切后，按前述方法挑取插入片段500～3 000 bp的克隆，测序拼接，最终获得了大肠杆菌O139,142,26的O-抗原基因簇的全序列，序列全长11 771 bp。

2.2 O-抗原基因簇分析

在获得混合O-抗原基因簇的全序列后，用ORF finder发现基因，共找到10个开放阅读框（ORF），都位于galF基因和gnd基因之间且具有相同的转录方向，都是从5′～3′方向。用Artemis软件完成基因注释后得到大肠杆菌O139,142,26的O-抗原基因簇结构及其（G+C）%含量，如图1所示。

图1 大肠杆菌O139,142,26的O-抗原基因簇结构

galF基因和gnd基因分别位于O-抗原基因簇的5′末端和3′末端，它们不属于O-抗原基因簇[5]。除这两组基因外O-抗原基因簇还含有3种酶基因，即单糖合成基因，糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因[3]。

2.2.1 单糖合成酶基因

通过进行BLAST比较发现，ORF1、ORF2、ORF3和ORF4都与许多菌的合成鼠李糖前体的4个合成酶基因有非常高的相似性，其中与大肠杆菌O139的rmlB、rmlD、rmlA、rmlC相似性最高，分别为97.63%、98.45%、99.66%、98.15%，并且都与鲍氏志贺氏菌的rml有97%以上相似性。可以确定 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4分别为合成dTDP-鼠李糖的rmlB、rmlD、rmlA、rmlC基因，因此分别命名为rmlB、rmlD、rmlA、rmlC。

2.2.2 寡糖单位处理基因

通过TMHMM和SMART分析，ORF5和ORF7是仅有的2个具有多个以上跨膜蛋白的序列，ORF5有11个跨膜蛋白，并在第2和第3个跨膜蛋白之间有一个含92个氨基酸残基的大型胞质茎环，这是wzy跨膜蛋白的典型结构[13]，经过BLAST保守蛋白分析，与大肠杆菌O139的O-抗原跨膜基因相似性达到99.75%；ORF7有9个跨膜蛋白，也具有高度特异性，与大肠杆菌O139O-抗原跨膜基因相似性达到99.43%。因此将ORF5与ORF7分别命名为wzy、wzx。

2.2.3 糖基转移酶基因

经过BLAST分析，ORF6、ORF8、ORF9、ORF10与大肠杆菌O139编码糖基转移酶wfaI、wfaJ、wfaK、wfaL，相似性分别为99.2%、98.88%、99.23%、98.7%，推测它们属于糖基转移酶家族类蛋白，但不能确定其作用的糖苷健类型，与其他菌也有一定的相似性，如ORF9与假单胞杆菌的wbpR糖基转移酶的相同性为36%，相似性为53%，所以根据其特点及与已发表的O139抗原基因有较高的同源性将ORF6、ORF8、ORF9、ORF10 命名为 wfaI、wfaJ、wfaK、wfaL[14]。

通过对每个ORF用BLAST系列软件与Gen-Bank中的基因比较预测出它们的功能如表1所示。

表1 O139,142,26大肠杆菌O-抗原基因簇中基因的功能Table 1 Function of genes on E.coli O139,142,26O-antigen gene cluster

2.3 大肠杆菌O139、O26及O142的O-抗原基因簇及糖基链的比较

根据GenBank中发表的 O139（序列号 DQ109 552）、O26（序列号AY763106）基因序列可知，除wzx与wzy 2个特殊的跨膜蛋白合成基因具有较高的特异性以外，其他开放阅读框都有部分相似性，如它们都含有合成鼠李糖前体的4个基因rmlB、rmlD、rmlA、rmlC，并且相似性都在93%以上，在其他的糖基转移酶中O139的wfaI、wfaJ糖基转移酶基因与O26的糖基转移酶基因fnl2、fnl1相似性为33.15%和33.5%，O139的wfaK、wfaL糖基转移酶基因与O26的糖基转移酶基因wbuB、wbuA相似性为30.95%和40.15%。

瑞典学者Landersjo等[15]对O142和O139的O-抗原外部糖基结构进行了测定，发现了它们重复的单糖结构。O142O-抗原含有 α-D-GalpNAc、α-L-Rhap、β-D-GlcpNAc；O139O-抗原含有 α-D-GlcpNAc、α-L-Rhap、α-D-GalpA、β-D-Glcp，它们的糖基大部分成分相同。比较O142O-抗原基因序列[16]，发现大肠杆菌O142也含有鼠李糖前体合成基因rmlB、rmlD、rmlA、rmlC，并且与O139相似性很高。

通过DNAMAN比对基因相似性，大肠杆菌O139,142,26与O139（序列号DQ109552）相似性为99.7%，与O26（序列号AY763106）相似性仅为44.15%。与大肠杆菌O139相比，O139,142,26全基因序列共有32处不同，各段开放阅读框相似性都在99%以上，除了合成鼠李糖前体的单糖合成酶基因（rmlB、rmlD、rmlA、rmlC）有21处不同外，就只有O139,142,26糖基转移酶基因wfaL与O139的糖基转移酶基因wfaL段出现了最多的6处不同，是相对其他片段变异较大的。而与大肠杆菌O26相比，除合成鼠礼糖前体的单糖合成酶基因相似性在75%以上，其他片段比对结果同大肠杆菌O139与O26比对结果相同，其中O139,142,26的糖基转移酶基因wfaL与O26糖基转移酶基因wbuA的相似性为40.15%，是相对于其他片段相似性较高的。

2.4 wfaL基因的进化分析

由于大肠杆菌O139,142,26与O139,的wfaL片段具有相对较高的变异性，大肠杆菌O139,142,26的wfaL片段与O26的wbuA片段具有相对较高的相似性，所以预通过wfaL氨基酸序列的进化关系来分析大肠杆菌O139,142,26、O139,、O26O-抗原之间的进化关系。经BLAST protein分析寻找wfaL的相似序列，从这些相似序列中选择了包括O139和O26在内的value值在5e-18以上的共17个序列，用MEGA进化树分析它们的同源性（见图2）。将O139,142,26暂时命名为E.mix，其他命名都为简写。从图2中可以看出O139,142,26与O139,落在一个分支里，和R.JMP134（蛋白序列号为YP_294950）是同一个祖先，都是糖基转移酶家族蛋白的成员，而O26和Psychromonas ingrahamii 37（蛋白序列号为YP_944740）落在同一分支里，与O139,142,26相距较远，属于糖基转移酶类似蛋白。因此，大肠杆菌O139,142,26的wfaL很可能是由大肠杆菌O139的wfaL单独演变而来的。

图2 根据相似蛋白序列构建的wfaL系统近化树Fig.2 Phylogenetic trees based on wfaL proteins sequences showing the relationships numbers in parentheses represent the accession number of the protain sequences in GenBank;the number at each branch points of the percentage supported by bootstrap

3 讨论与结论

在O-抗原基因簇中，寡糖单位处理酶基因包括O-抗原转运酶基因wzx和O-抗原聚合酶基因wzy，由于wzx、wzy跨膜基因的高度特异性，近年来有学者用分段设计wzx、wzy序列引物的PCR方法来快速准确地鉴定大肠杆菌的血清型[17-19]，说明这两个基因片断对O-抗原免疫原性的形成具有决定性作用。但是由于O139,142,26和O139大肠杆菌的wzx、wzy跨膜基因相似性很高，所以用PCR方法很难将它们区分开。根据二级结构预测抗原决定簇方法[20]，分析O139,142,26与O139跨膜基因，预测到wzy的第99位和第330位氨基酸的突变部位很可能处于抗原决定簇内，这些突变很可能改变wzy跨膜蛋白的性质，如拓扑学变化，解旋及亲水集团的转移等，从而使形成的糖前体在跨膜转运时发生变化，引起O-抗原糖基链的改变，从而出现混合血清型现象。以上对大肠杆菌O-抗原混合血清型产生的原因分析还需进一步研究证明。

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