人乳腺癌干细胞异种移植动物模型的制备和应用

许炜茹，林洪生，陈信义，张英

(1.中国中医科学院 广安门医院肿瘤科，北京 100053;2.北京中医药大学，北京 100029)

人乳腺癌干细胞异种移植动物模型的制备和应用

许炜茹1，2，林洪生1，陈信义2，张英1

(1.中国中医科学院 广安门医院肿瘤科，北京 100053;2.北京中医药大学，北京 100029)

越来越多的证据显示乳腺癌干细胞是导致乳腺癌发生、发展、复发和转移的根源。因此，模拟出与人乳腺癌发病机制相似的动物模型将对乳腺癌的治疗起着至关重要的作用。本文旨在介绍乳腺癌干细胞异种移植动物模型的制备方法、应用以及近年来的研究进展。

乳腺癌;干细胞;动物

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈迅速上升趋势，在女性各类肿瘤中居首位［1］。乳腺癌的预防、诊断和治疗已经成为肿瘤研究的热点。近些年，随着干细胞理论研究的不断深入，越来越多的证据表明肿瘤中存在一小群肿瘤干细胞(cancer stem cell)，它们具有自我更新及形成肿瘤的各种不同谱系细胞的能力，它们是导致肿瘤产生以及肿瘤复发和转移的根源。因此，如何能针对肿瘤干细胞而研制出有效的药物才能从根本上战胜癌症。目前建立了乳腺癌干细胞异种移植的动物模型，但是这种模型还处于初级阶段，有些肿瘤干细胞的成瘤率还不尽人意，并且近些年的研究也仅局限于乳腺原位接种成瘤。因此，如何能模拟出与人乳腺癌发病机制相似的动物模型是亟待解决的问题，以便提供有价值的动物模型来寻求更好的治疗策略。

1 实验动物的选择

人乳腺癌细胞异种移植要求都是免疫缺陷的动物模型，故人体肿瘤异种移植时无排斥反应，移植后的人体肿瘤保持其原有的组织形态，免疫学特点以及特有的染色体组型和对抗肿瘤药的原有敏感性。常选用的动物主要有重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠、非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID)小鼠、裸鼠。

Bosma等［2］首次在 C.B-17Icr小鼠中发现单个隐性突变基因(scid基因)，纯合 scid基因导致 T、B淋巴细胞不能分化为特异性功能淋巴细胞，此突变型小鼠即SCID小鼠。该品系小鼠T、B淋巴细胞功能缺陷，NK细胞及巨噬细胞功能正常。此外，文献报道2%～23%的SCID小鼠出现淋巴细胞免疫功能恢复(渗漏现象)［3］，故该品系的小鼠仍可对移植物产生一定的免疫排斥反应［4］，因此影响了 SCID小鼠的更广泛应用。

Jackson实验室将非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt与SCID小鼠杂交后获得 NOD/SCID小鼠［5］。该品系小鼠保留了 SCID小鼠 T、B淋巴细胞缺陷的特点，同时还具有 NK细胞活性低、抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)功能缺陷的特征。此外，NOD/SCID小鼠渗漏现象少。鉴于 NOD/SCID小鼠具有多种先天和获得性免疫缺陷，不易发生免疫逃逸，其异种移植成功率较SCID小鼠明显提高。并且裸鼠体内雌激素(E2)、孕激素水平均较NOD/SCID小鼠低［6］，对于乳腺癌这种激素依赖性的肿瘤来说，高激素水平的NOD/SCID小鼠更适合其肿瘤细胞的生长。因此NOD/SCID小鼠在人乳腺癌干细胞成瘤模型中最为常用。但是，NOD/SCID小鼠胸腺淋巴瘤的发生率较高，在SPF条件下平均寿命仅有8.5个月［7］，生存时间较 SCID鼠短，这限制了移植瘤的长期研究。

裸鼠即纯合子nu/nu基因突变小鼠，全身形似无毛，呈裸体状，无胸腺，T淋巴细胞功能缺陷，对体外移植物的免疫排斥反应较低［8］。但其免疫缺陷程度没有SCID和NOD/SCID小鼠重，故在肿瘤干细胞异种移植的成瘤动物模型中没有前两者常用。但是异种移植接种的部位都是在乳腺原位，而裸鼠无毛易于接种;人乳腺癌干细胞异种移植接种的细胞数量级很低，成瘤时间较长，裸鼠无毛的特点也易于动态观察肿瘤的生长状态;并且裸鼠较SCID和NOD/SCID小鼠价格便宜。

总的来说，这三种小鼠用于异种移植成瘤模型各有利弊，还需要根据实验的具体要求选择合适的小鼠。

2 原位乳腺癌干细胞异种移植常用的制备方法

2.1 异种移植前小鼠的准备

2.1.1 人源化小鼠的乳腺:在移植乳腺癌干细胞之前使移植的小鼠乳腺人源化能利于人乳腺癌细胞的生长［9］。小鼠乳腺在青春前期被清除，并且注射一种被放射过的和未被放射过的人成纤维细胞混合物。放射过的人成纤维细胞(4Gy)能分泌各种生长因子、胶原，因此能支持正常细胞和癌上皮细胞的生长［10-11］。此种动物模型的建立曾被 Kuperwasser等［12］用于正常乳腺上皮细胞的移植。永生的成纤维细胞是将原代的人乳腺成纤维细胞转染逆转录病毒而表达端粒末端转移酶。乳腺癌干细胞在人源化的乳腺建立2～4周后再移植至小鼠的乳腺内。

2.1.2 降低小鼠的免疫力:极低数量级的人乳腺癌干细胞移植到小鼠体内仍然能存活，而并没有因为小鼠自身的免疫力而被清除。Al-Hajj等［13］利用化疗药物依托泊苷腹腔注射入移植前的小鼠体内，使NOD/SCID小鼠的免疫力进一步下降从而有利于干细胞的生长。

2.1.3 提高小鼠体内的E2水平:E2受体阳性的人乳腺癌细胞异种移植后需要给小鼠补充一定量的E2，常用60 d缓释的 0.72 mg的 17β-E2片，或每隔10 d，每只小鼠皮下注射0.4 mg/kg E［14］2，使小鼠血清E2保持在一定的水平。但是，E2促进肿瘤生长的同时，也带来了副作用。其中肾损伤和膀胱结石是导致小鼠死亡的主要原因。因此，E2如何能促使乳腺癌细胞生长的同时还能尽可能减少对小鼠的损伤是急需解决的难题。Kang等［15］报道90 d缓释的0.18 mg低剂量的17β-E2缓释片不仅能促进乳腺肿瘤的生长，并且埋这种缓释片小鼠的死亡率显著下降。故在今后的乳腺癌干细胞异种移植成瘤实验中可以尝试应用。此外，除了E2受体阴性的人乳腺癌细胞异种移植后的生长和转移也依赖于 E2。研究发现药理学浓度的17β-E2可以抑制裸鼠的 NK细胞活性，给移植E2受体阴性肿瘤的裸鼠一定量的E2可以促进肿瘤的转移［8］。因此，无论是 E2受体阴性或是阳性的人乳腺癌干细胞异种移植时均可给予E2以提高成瘤率。

2.2 细胞的制备—基质胶

乳腺癌干细胞异种移植时通常将干细胞悬液混合一定的基质胶以提高成瘤率，混合的比例通常为1∶1。基质胶是由层粘连蛋白、IV型胶原纤维、硫酸乙酰肝素和巢蛋白组成的混合物，在4℃为液体，而在37℃则聚合形成一种凝胶［16-17］。基质胶混合物增加异种移植瘤的成活率可能是因为它能形成一个有效的屏障，使肿瘤细胞免于局部免疫效应细胞的攻击。此外，基质胶也提供一个自然的结构或立体空间，使瘤细胞接近一些粘附分子或促有丝分裂分子，如层粘连蛋白、纤维连接蛋白和 IV型胶原纤维［8］。

3 异种移植的动物模型

3.1 原位成瘤动物模型

目前，乳腺癌干细胞异种移植的动物模型分为原代移植和细胞系移植。2003年 AL-Hajj等［13］首次分离出了实体肿瘤干细胞，他们从乳腺癌患者的恶性胸腔积液分离出一类表型为 CD44+CD24－/lowESA+的癌细胞，仅约200个细胞即可在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤，成瘤率为100%。乳腺癌细胞系也广泛应用于异种移植的动物模型中，如常用的乳腺细胞系MCF-7，MDA-MB-231。但是，有些细胞系中尚未被发现乳腺癌干细胞。

乳腺癌干细胞异种移植常接种于小鼠的乳脂垫(mammary fat pad)［9，13-14，18］。如 Al-Hajj 等［13］成 功将CD44+CD24－/lowESA+乳腺癌干细胞接种于NOD/SCID小鼠的乳脂垫内并形成肿瘤。Price等［19］曾对比皮下接种和乳脂垫接种的差异。该研究利用细胞株 MDA-MB-231和 MDA-MB-435分别进行皮下注射接种和乳脂垫接种。结果发现乳脂垫接种后的成瘤率为100%，而皮下途径为40%，并且乳脂垫接种后转移率也提高。因此，这种原位移植不仅可以提高乳腺癌细胞的成瘤率而且可以增加转移的发生率。

3.2 乳腺癌转移动物模型

Croker等［20］通过鼠尾静脉分别注射人乳腺癌细胞系的干细胞 ALDHhiCD44+CD24－，发现注射MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞系的NOD/SCID小鼠分别在5～7周和12周后会出现肺和其他器官的转移灶。目前，乳腺癌干细胞的标志物还在继续摸索之中，所以研究的热点主要集中在原位异种移植，而乳腺癌干细胞转移动物模型的建立还非常少。Croker等建立的乳腺癌转移的动物模型，为乳腺癌干细胞转移动物模型的建立奠定了良好的基础，今后的研究应从乳腺癌细胞系的干细胞逐渐向原代乳腺癌干细胞转移，从而真正建立乳腺癌干细胞转移的动物模型。

4 结语

同大多数实体瘤一样，乳腺癌患者死亡的主要原因是转移和复发，转移是肿瘤细胞最难复制的特性［21］。而肿瘤干细胞目前被认为是肿瘤复发和转移的根源，因此如何能利用肿瘤干细胞的这种特点模拟出肿瘤复发和转移是当前亟待解决的难题。本文介绍了近年来乳腺癌干细胞异种移植动物模型的建立，但是目前研究水平有限，有些低数量级的乳腺癌干细胞的成瘤率还较低，不足以模拟出人体内的乳腺癌复发和转移。这种低成瘤率也限制了对乳腺癌干细胞在动物体内的药物学研究。并且目前的研究还仅限于乳腺原位的异种移植，极少涉及乳腺癌干细胞转移模型的建立。因此，今后的研究可以进一步探索乳腺癌转移模型的建立。

［1］ Kellen E，Vansant G，Christiaens MR，et al.Lifestyle changes and breast cancer prognosis:a review［J］.Breast Cancer Res Treat，2009，114(1):13－22.

［2］ Bosma GC， CusterRP， Bosma MJ. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse［J］.Nature，1983，301(5900):527－530.

［3］ Dorshkind K，Keller GM，Phillips RA，et al.Functional status of cells from lymphoid and myeloid tissues in mice with severe combined immunodeficiency disease［J］.J Immunol，1984，132(4):1804－1808.

［4］ Dorshkind K，Pollack SB，Bosma MJ，et al.Natural killer(NK) cells are presentin mice with severe combined immunodeficiency(Scid)［J］.J Immunol，1985，134(6):3798－3801.

［5］ Prochazka M，Gaskins HR，Shultz LD.The nonobese diabetic SCID mouse:model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1992，89(8):3290－3294.

［6］ Kopf－Maier P，Mboneko VF.Anomalies in the hormonal status of athymic nude mice［J］.J Cancer Res Clin Oncol，1990，116(3):229－231.

［7］ Camacho RE，Wnek R，Fischer P，et al.Characterization of the NOD/scid-［Tg］DR1 mouse expressing HLA-DRB1*01 transgene:a model of SCID-hu mouse for vaccine development［J］.Exp Hematol，2007，35(8):1219－1230.

［8］ Clarke R.Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer.The immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines［J］. Breast Cancer Res Treat，1996，39(1):69－86.

［9］ Ginestier C，Hur MH，Charafe-Jauffret E，et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome［J］.Cell Stem Cell，2007，1(5):485－487.

［10］ Orimo A，Gupta PB，Sgroi DC，et al.Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion［J］.Cell，2005，121(3):335－348.

［11］ Tlsty TD，Hein PW.Know thy neighbor:stromal cells cancontribute oncogenic signals［J］.Curr Opin Genet Dev，2001，11(12):54－59.

［12］ Kuperwasser C，Chavarria T，Wu M，et al.Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101(14):4966－4971.

［13］ Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci，2003，100(7):3983－ 3988.

［14］ Ponti D，Costa A，Zaffaroni N，et al.Isolation and in vitro propagation oftumorigenic breastcancer cells with stem/progenitor cell properties［J］.Cancer Res，2005，65(13):5506－5511.

［15］ Kang JS， Kang MR， HanSB， etal.Low doseestrogen supplementation reduces mortality of mice in estrogen-dependent human tumor xenograft model［J］.Biol Pharm Bull，2009，32(1):150－152.

［16］ Mehta RR，Graves JM，Hart GD，et al.Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice［J］.Breast Cancer Res Treat，1993，25(1):65－71.

［17］ Friman R，Kibbey MC，Royce LS，et al.Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel［J］.J Natl Cancer Inst，1991，83(11):769－774.

［18］ Charafe-Jauffret E，Ginestier C，Iovino F，et al.Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature［J］.Cancer Res，2009，69(4):1302－1313.

［19］ Price JE，Polyzos A，Zhang RD，et al.Tumorigenicity and metastasis of human breast carcinoma cell lines in nude mice［J］.Cancer Res，1990，50(3):717－721.

［20］ CrokerAK， Goodale D， Chu J， etal. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability［J］.J Cell Mol Med，2008，13(8):2236－2252.

［21］ Price JE.Metastasis from human breast cancer cell lines［J］.Breast Cancer Res Treat，1996，39(1):93－102.

Establishment and Application of Animal Models of Xenotransplantation of Human Breast Cancer Stem Cells

XU Wei-ru1，2，LIN Hong-sheng1，CHEN Xin-yi2，ZHANG ying1
(1.Oncology Department，Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China;2.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Accumulating evidence shows that breast cancer stem cells are the origin of carcinogenesis，tumor progression，relapse and metastasis.Therefore animal models simulating similar pathogenesis of human breast cancer will play an important role in the research on treatment of breast cancer.This review aims to introduce the method，application and progress of in research on animal models of human breast cancer stem cells.

Breast cancer;Stem cell;Animal

R737.9，332

A

1005-4847(2010)05-0429-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2010.05.16

2010-03-08

国家自然科学基金(编号:30772867)。

许炜茹(1983－)，女，北京中医药大学，2008级博士研究生。

林洪生(1949－)，女，主任医师，博士生导师。Tel:010-88001192，E-mail:drlinhongsheng@163.com