口蹄疫核酸疫苗的研究进展

王 猛，刘永生，张 杰

(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室 农业部兽医公共卫生重点开放实验室，甘肃 兰州 730046)

口蹄疫 (FMD)是由口蹄疫病毒 (FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病呈世界性流行，一旦暴发将给世界各国的畜牧业造成了巨大的经济损失，使得人们在应对它时，必须侧重于早期的防治。疫苗作为预防、控制传染病的发生和流行的主要手段，在防控口蹄疫方面担任着重要角色。口蹄疫疫苗主要经历传统疫苗和基因工程疫苗两个阶段。虽然灭活疫苗和弱毒疫苗在防止口蹄疫的流行中发挥了重要作用，但是随着防疫标准的提高及对生物安全的考虑，传统疫苗开始显露出种种缺陷，如对灭活苗免疫动物和自然感染动物区分不便，疫苗保存较耗时耗材，弱毒苗安全性较低等。随着分子生物学研究的深入，基因工程疫苗成为目前研究的热点。其中核酸疫苗由于生产工艺简单、便于保存和运输、无感染性、无反强且抗原相关表位稳定等优点受到广泛关注。

1 口蹄疫病毒的抗原性片段

FMDV的抗原位点多位于衣壳蛋白的环结构上。FMDV衣壳蛋白 VP1-4都含有 T细胞表位。VP2-4至少含有10有活性的 T细胞表位，其中VP2和VP3上居多，但是在分离的结构蛋白中只有VP1才能诱导中和抗体的产生［1］。FMDV的VP1 G-H环上，有诱导生成B细胞的位点，也有激发产生 Th细胞的位点，Zamorano等［2］对 FMDV的Campos株的研究表明，在 VP1的135～140位和150～160位氨基酸残基上，有2个 T细胞抗原表位。虽然不同血清型的病毒抗原位点的组成有所不同，VP1的G-H环已被公认包含重要的抗原决定簇［3］。生产核酸疫苗时保护性抗原基因可以是单个的基因 (如VP1)也可以是一组基因 (P1、2A、3C和3 D)，还可以是编码VP1抗原位点的多个表位 (如VP1的141～160位氨基酸、200～213位氨基酸)［4］。

2 核酸疫苗的作用机理

研究表明核酸疫苗不仅可诱导体液免疫反应，还可以诱导细胞免疫应答。重组质粒一般通过肌肉或者皮内导入机体后，被周围组织细胞(比如肌细胞或者表皮胶原细胞)，抗原递呈细胞(APC)或者其它炎性细胞摄取。未被摄取的游离DNA多数可被降解，少数可能随循环系统而进入淋巴结或脾中。有实验已经证明，肌细胞、上皮细胞和黏膜细胞有较强地摄取 DNA分子的能力［5］。之后被摄取的重组质粒在细胞核内转录mRNA并在细胞内表达病原体的蛋白质抗原，经加工后形成的多肽抗原，可与宿主细胞主要组织相容性复合物MHCⅠ和 MHCⅡ分子结合，并被递呈给宿主的免疫识别系统，从而引起特异性体液和细胞免疫应答［6-7］。

3 FMD核酸疫苗的研究进展

最早有关核酸免疫研究的报道是从1990年Wolff等［8］将质粒接种于小鼠的肌肉中开始的，而最初构建的口蹄疫的基因疫苗是一个包含FMDV A12株cDNA全基因组的质粒pWRM。但由于全基因组具有一定的危险性，以后的研究者开始致力于只表达FMDV抗原表位的核酸疫苗的研究。

之后研究人员开始构建的DNA重组疫苗表达FMDV VP1衣壳蛋白的抗原表位，因为VP1上的B细胞表位能够诱导中和抗体的产生。Wong等［9］利用编码FMDV VP1基因表位的重组质粒，生产一种口蹄疫核酸疫苗，实验证明可以诱导猪和小鼠的免疫反应。此外也有表达整个P1基因的，但是要同时表达3 C基因，3 C编码一种蛋白酶，裂解P1-2A 成为正确的抗原表位［10］。Benvenisti等［11］将FMDV完整的结构基因P1和非结构基因2 A、3 CD串联起来，同时加入脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点，通过免疫荧光和免疫斑点技术检测到病毒蛋白在体外表达和加工，利用基因枪注射到猪皮肤中，发现有部分猪可抵抗FMDV强毒的攻击。2005年Yang Ning-su等［12］分别构建编码部分 VP1抗原位点、完整的VP1和P1的表达质粒，同样的方法免疫接种10周龄的BALB/cByJ小鼠后，发现编码部分VP1抗原位点的核酸疫苗不能很好地诱导抗VP1的蛋白或者中和抗体，而完整的VP1能够诱导较强烈的抗体反应，但在接种106TCID50(半数组织感染量)的强毒48 h后不能有效抑制病毒粒子的复制。表达P1的核酸疫苗不仅能够诱导较强烈的中和抗体，而且80%～100%的小鼠在接毒48 h后，血清中完全清除了病毒粒子。

随着RNA干扰兴起，编码特异性沉默3 D和5’UTR(已证明两者在FMDV复制过程中发挥重要作用)的sh RNA(短发夹RNA)，即3 D sh RNA。接种了3D sh RNA 18 h后，BHK-21细胞抑制102TCID50的强毒复制的能力增加了3倍。接种4～6周龄的豚鼠7 d后，80%的豚鼠能够抵御103TCID50的 FMDV 强毒的攻击［13］。

4 增强FMD核酸疫苗免疫原性的研究进展

大量的研究证明单纯的病毒表位诱导的免疫反应很弱，而且持续的时间很短，再加上核酸疫苗本身就有表达量低，免疫力较弱的缺点［14］，因此研究人员开始尝试将衣壳蛋白编码区与一些非编码区基因或者是共刺激因子共同构建于同一个质粒载体中，试图诱导更强更持久的免疫反应。

Jong等［15］通过构建包含 p1-2A/IL-1α (细胞介素-1α)和VP1/IL-1α同时加入人细胞巨化病毒内部核糖进入位点，通过免疫荧光和Western blotting确定了VP1或P1和IL-1α的表达。皮下接种小鼠后，检测到IgG1和IgG2 A分子浓度都有很大的提高，证实了IL-1α对免疫诱导的增强作用。

Daniel等［16］构建了包含FMDV P1-2A3 C3 D(2A、3 C、3D均为口蹄疫的非结构蛋白，它们参与RNA的复制，多聚蛋白的裂解和结构蛋白的折叠与装配等过程)和GM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)的重组质粒载体，通过皮下每2～3周加强一次 (共3次)免疫猪后发现构建的核酸疫苗诱导产生了较高水平的FMDV中和抗体。

Lu Huijun等［17］构建共表达P12 A-IL18-3 C的质粒，然后加入化学佐剂左旋咪唑免疫猪，28 d后接种103TCID50的O型强毒，20 d后发现实验组的猪检测到了高滴度的中和抗体和特异性抗体，并检测到较高的T淋巴细胞和IFN-γ增殖率。

随着研究的深入，相继研制出了一些能有效改善核酸疫苗免疫应答的佐剂制品，并运用到FMD的核酸疫苗中来。如细胞因子，协同刺激分子以及补体。如IL-15、IL-2、IL-1β、IL-18、C3 d、CTLA4、PLGA(聚乳酸聚乙醇酸共聚物)等都用于构建cDNA质粒，且收到了较高的免疫反应［18-21］。此外，Suk-Am 等［22］证明 FMDV 核酸 疫苗注入时采取电穿孔的方式要比基因枪或者其它方式产生的免疫反应强烈。

5 展望

核酸疫苗在安全性、稳定性、制备运输等方面具有其它疫苗无法比拟的优势。目前随着防疫标准的逐渐提高，口蹄疫传统疫苗的局限性日益突出，核酸疫苗作为基因疫苗的代表，其必定能在未来的疫苗研究中扮演举足轻重的角色。但对它的研究仍处于初级阶段，还没有商业化的核酸疫苗，且其致病机理依旧不是很清楚，免疫原性低，免疫耐受现象，及对基因安全性的困扰依旧需要科研人员进行大量的研究。但是不可否认的是，对DNA疫苗的探索，对口蹄疫的防治甚至整个畜牧业的健康发展都将带来划时代的意义。

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