线粒体 DNA突变与衰老

李豪杰 代会莹 扈 盛 胡亚哲

(华中师范大学体育学院,湖北 武汉 430079)

衰老又称老化,通常是指在正常状况下生物发育成熟后,随年龄增加,自身功能减退,内环境稳定能力与应激能力下降,结构、组分逐步退行性改变,趋向死亡,不可逆转的现象〔1〕。1956年,Harman首先提出来衰老的自由基假说,之后又提出人类衰老过程中线粒体 DNA是自由基攻击的首要目标。19世纪80年代初 Miquel等提出“细胞衰老学说”,认为衰老是由于氧自由基攻击线粒体DNA引起的一个生物过程。1989年 Linnane等提出线粒体衰老假说。随着时代的发展与科技的进步,人们越来越关注线粒体与衰老的关系,线粒体与衰老的关系也成为研究前沿。

1 线粒体DNA的生物学特征

1.1 线粒体DNA的结构 1963年Nass通过鸡胚实验研究发现线粒体中含有核糖核酸类物质——DNA;1981年 Anderson检测了人类 mtDNA分子序列;同年,Bibb等完成对大鼠 mtDNA测序。人类 mtDNA分子长度为 16 569 bp,是闭合环状超螺旋结构,其外环因含鸟嘌呤较多、胞嘧啶较少而分子量较多称为重链(H),内环因含胞嘧啶较多、鸟嘌呤较少而分子质量较小称为轻链(L)。除有 1个与 DNA复制起始有关的 8 bp的 D环(D-Loop)外,其他均没有内含子。人类 mtDNA有 37个编码基因,分别是 22个 tRNA基因,2个 rRNA基因和 13个蛋白质基因。蛋白质基因分别为 1个编码复合体Ⅲ细胞色素 b氧化酶基因,2个编码复合体Ⅴ的 ATP酶亚单位 6和 8基因,3个编码复合体Ⅳ的细胞色素c氧化酶亚单位基因和 7个编码复合体Ⅰ呼吸链烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位基因。2个 rRNA基因(12 S、16 S)和 22个 tRNA基因位于 D环之后,各基因之间没有间隔区,即 1个基因的最后一个碱基与相邻的基因第一个碱基相邻,甚至出现重叠现象〔2〕。

1.2 线粒体DNA的遗传特点 ①母系遗传:1980年 Giles等对几个欧洲家系线粒体基因进行了单核苷酸多态性分析,发现mtDNA分子严格按照母系遗传方式进行传递。母系遗传是指只有母亲能将其mtDNA分子传递给下一代,然后通过女儿传播给后代。②异质性和突变负荷:线粒体基因突变可发生在成千上万个 mtDNA分子上,由此产生了突变量介于 0到 100%之间的 mtDNA突变体。人们将细胞或组织同时拥有突变型和野生型 mtDNA的状态称为异质性;将细胞或组织只拥有一种mtDNA的状态称为均质性〔3〕。异质性可分成长度异质性和位点异质性两类。长度异质性的大多数情形是线粒体基因组的某一段,主要是D环区的串联重复,现存的长度异质性多被认为是中性选择的结果〔4〕。位点异质性表现在一个或多个核苷酸位点上不同的 mtDNA,即主要是由于DNA上某个或数个碱基的转换、颠换、插入或缺失等点突变所产生的,引起个体内的mtDNA异质性〔5〕。突变负荷是指发生突变的 mtDNA占全体mtDNA的百分比,它是衡量 mtDNA突变体异质性程度的重要指标。③阈值效应:当异质性 mtDNA突变体的突变负荷较低时,与突变型mtDNA共存的野生型 mtDNA会发挥足够的补偿作用,以维持线粒体呼吸链的功能。然而,当突变负荷超过一定范围,使得野生型mtDNA的数量不足以维持呼吸链的功能时,组织或器官就会出现异常,这种现象被称为阈值效应。④“瓶颈”和随机分配:异质性 mtDNA突变体的突变负荷高低在不同的世代交替间变化显著,这种效应称为线粒体遗传的“瓶颈”〔6〕。每个卵母细胞有数千个至上万个 mtDNA拷贝,但只有2～200个可以传递给子代,这一过程中mtDNA拷贝数目成倍减少。瓶颈效应发生的时间不同,mtDNA数目和种类的削减程度也不同。在有丝分裂时,mtDNA被随机分配到子代细胞中。

2 衰老的生物学特征

衰老是从性成熟后才开始或加速的一种带普遍性、渐进性且不可逆转的生命过程,其表现在物种的整体、器官与组织、细胞与分子等各个水平。一般说来,线粒体数量随年龄而减少。对老年小鼠下丘脑神经内分泌细胞的观察发现:在正常情况下线粒体数量无年龄差异,但老年小鼠在渗透负荷的应激状态下,线粒体数量大量减少。形态学上可见老年机体内线粒体常增大变形,嵴与基质减少或出现空泡。钱杰等〔7〕通过电镜观察发现:衰老小鼠心肌组织中可见线粒体数目少、排列紊乱、线粒体肥大、肿胀,畸形较多,外膜、嵴部分消失。一般认为随年龄的增加,mtDNA的相对数量会增加。王学波等〔8〕研究发现外周血单个细胞的线粒体 DNA含量随年龄增加而增多;Lee等〔9〕通过对 49例年龄为 16～85岁的健康人研究也发现:80岁以上的人肺 mtDNA的数量比 20岁以下的约高 2～6倍,认为这可能是衰老时肺功能下降的一种补偿机制。目前关于 mtDNA含量增加的机制尚不完全清楚,可能的机制报道较多的主要有:①代谢反馈机制,认为衰老时,线粒体一方面通过增加未受损的正常线粒体的工作量来代偿,一方面通过增加线粒体的数量来代偿。②快速复制机制,较正常mtDNA短而有缺失的mtDNA,具有复制的优势性,造成细胞内大量无功能的 mtDNA的堆积。③调节失控机制,野生型 mtDNA的控制作用因基因突变而抑制或失活,突变型DNA的量就超过野生型,导致与细胞能量状态及代谢需要无关的突变型mtDNA的堆积。

3 线粒体DNA突变与衰老

3.1 线粒体DNA的易受损性和突变原因

3.1.1 线粒体DNA的易受损性 线粒体 DNA易受损性和突变是与其结构、遗传特点密切相关的。线粒体DNA分子上为核苷酸结合蛋白,缺少组蛋白的保护,而且线粒体内没有 DNA损伤修复系统,这就导致了 mtDNA容易突变〔10〕。具体地说,mtDNA几乎不受DNA结合蛋白的保护,即裸露在线粒体内部,易受外界因素的干扰;线粒体内脂肪/DNA的比值很高,使具有嗜酸性的致癌物质优先在 mtDNA上聚集;mtDNA在整个细胞中一直处于不停的合成状态;线粒体是细胞的动力工厂,氧浓度较高,且易产生氧自由基及过氧化氢等活性氧族,自身又缺乏有效的清除系统,故 mtDNA易受活性氧损伤〔11〕;mtDNA在复制时由于 mtDNA多聚酶 γ的校对性差,以及 tRNA基因部位易形成发夹样结构,导致其复制错配率明显高于核 DNA〔12〕。

3.1.2 线粒体DNA的突变原因 目前认为,活性氧在细胞体内堆积造成的损伤是衰老时线粒体DNA突变的主要原因〔12〕。对培养的细胞,给予氧化应激,产生过多的活性氧后,对线粒体DNA的损害程度远比核 DNA高,而且持续的时间长。Ozawa〔13〕的研究表明:线粒体内的活性氧可造成 mtDNA的断裂、能源危机、细胞凋亡、细胞萎缩及点突变和缺失。Adachi等〔14〕观察到适当补充辅酶 Q10可以阻止 mtDNA的缺失,降低心肌线粒体脂质过氧化水平。这直接证明了活性氧与 mtDNA突变有直接的关系。研究表明,mtDNA缺失与 8-羟基-脱氧鸟苷酸(8-OH-d G)的含量呈明显相关性〔13〕。 Lezza〔15〕等通过对 6名健康老人和 7名患 Alzheimer病的老人实验研究显示:健康老人体内 mtDNA 4 977 bp的缺失与 8-OH-dG的数量呈明显的正相关,相反,患 Alzheimer病的老人却没有出现相关性。认为此现象是因为 mtDNA内过多的自由基导致 mtDNA双链的分解,将有助于DNA复制过程中缺失突变的发生。有两种主要的mtDNA复制模型:线性异步复制模型和后随链复制模型〔16〕。这两种模型认为 mtDNA缺失是由于 mtDNA复制错误而引起的。大多数报道的 mtDNA缺失是凭借一种滑动复制机制发生在主要弧区,但这种机制绝大程度上认为 mtDNA是异步复制,因为该理论认为线粒体内大部分是单线型DNA。不过最近的研究认为大部分的单线型 DNA是不存在的,并且在一定程度上后随链模板受 RNA保护。Nishigaki〔17〕等通过 36例病人组织和细胞的点突变研究发现:有 31例点突变是T-C的转化,同时还检测出一个单碱基对的普通缺失和一个TT-AA的点突变。这一实验结果首次证实了腺苷的代谢作用会诱发多种序列点突变。其潜在的机制是:胸苷磷酸化酶的缺乏,增加了脱氧胸苷和嘧啶的数量导致线粒体核苷酸库的不平衡,由此导致mtDNA的畸形,进而产生突变。 David〔18〕等通过对 263例人类不同的 mtDNA缺失研究表明:mtDNA缺失突变的发生与野生型mtDNA的基本特征没有相关性,但是与核苷酸 8470和 13447的两个位点 13-bp的重复有着显著的相关性。大多数的mtDNA缺失的出现都与这两个位点的重复有关,暗示mtDNA的普通缺失与 mtDNA的复制有关。mtDNA聚合酶(Pol-r)是仅位于线粒体的酶而且是 DNA靶子,被认为是 mtDNA合成的主要原因,包括线粒体基因的复制和 DNA损伤的修复,Trifunovic等〔19〕研究认为 Pol-r引起 mtDNA突变的潜在机制是:Pol-r能引起线粒体内蛋白质功能异常而造成氧耦合缺陷使 ATP消耗增加导致活性氧族生成增多,引起 mtDNA损伤和突变。Krishnan〔20〕研究认为:mtDNA的缺失发生在对损伤 mtDNA修复过程中,起始单链区mtDNA缺失是因 mtDNA在双链解旋过程中核酸外切酶活动引起。增加抗氧化剂和清除氧自由基的物质能够阻止双链 DNA断裂(DSBs)的产生,因此也就阻止 mtDNA缺失。

3.2 与衰老相关的线粒体DNA突变 1988年 Holt等人首次证实了线粒体病与线粒体突变之间的关系。现已证实多种与衰老相关的退行性疾病都与mtDNA突变有关,诸如早老性痴呆、帕金森综合征、肌萎缩运动型神经障碍等都是由于 mtDNA突变引起的神经系统或肌肉组织病变。目前已证实至少 5种mtDNA突变与衰老有关:①mtDNA的缺失;②点突变;③插入;④串联重复;⑤DNA重排。至今,已有 250多种 mtDNA点突变和不计其数的mtDNA重组突变被报道与人类疾病相关,与衰老相关的 mtDNA突变主要是缺失、点突变和重排。

3.2.1 线粒体DNA缺失突变与衰老 与衰老相关的 mtDNA缺失最早见于 Lkebe等对帕金森病患者脑组织 mtDNA缺失的研究中,所有的患者都检测到 4 977 bp缺失。之后又发现缺失存在于人的心肌、骨骼肌、肝、肾等多种组织和细胞中。从病理分类,主要有两类缺失:单个缺失和多重缺失〔21〕。单个缺失的分子数量常占总线粒体 DNA的 20%～80%,多重缺失常见于组织的正常衰老过程。曾昭惠等〔22〕对小鼠衰老和缺血时脑细胞线粒体 DNA片段缺失的研究表明:老年鼠大脑细胞中mtDNA有片段缺失,中青年鼠无缺失现象;缺血可导致鼠脑细胞mtDNA片段缺失,但老年鼠更加明显。初步证实了 mtDNA片段的缺失与增龄有关。吴晓晶等〔23〕采用 Southern杂交及聚合酶链反应(PCR)方法对 48例不同年龄组人白细胞进行线粒体DNA缺失的分析表明:线粒体DNA缺失发生率及相对含量均随增龄而增加。现阶段研究较多的是线粒体 DNA 4 977 bp的缺失(大鼠对应的是 4 834bp缺失),在体内多个组织中可检测出此缺失,故此缺失又叫做共同缺失。Meissner〔24〕等采用 PCR检测法对 92名被试的大脑内的黑质、尾状核、壳核、额叶、小脑及右心室、左心室和髂腰肌的线粒体 DNA进行检测,发现在mtDNA的 123位点出现 4 977 bp的缺失,并且所有的缺失都与增龄出现极其显著的正相关。

3.2.2 线粒体DNA点突变与衰老 mtDNA的点突变可分为tRNA的点突变和编码蛋白基因的点突变。tRNA的点突变常见于线粒体 RNA基因上 3 243位点的 A突变成G,该突变可阻碍 mtDNA编码的蛋白质合成,并可导致 rRNA转录终止,多见于线粒体神经肌肉性疾病。16例少年 mtDNA的观察表明:tRNA的点突变可在成年衰老组织中检测出而在少年组织中未发现,并且该突变随年龄的增加而呈现积累趋势。

3.2.3 线粒体DNA重排与衰老 Wallace等曾报道随年龄的变化线粒体氧化磷酸化能力下降是由于mtDNA重排的积累引起的。随后的研究中,通过聚合酶链反应在衰老的骨骼肌及脑组织中也发现了 mtDNA重排,推测 mtDNA的重排与衰老有关。Coskum等〔25〕对人类线粒体的遗传特性研究的时候发现:有丝分裂后组织中 mtDNA重排随年龄积累,这个年龄点一般是 45岁左右。Chinnery等〔26〕通过对健康老人大脑组织中mtDNA控制区的研究发现,在多个组织中都发现不同的 mtDNA重排随衰老积累,但是并没发现点突变有明显的积累。线粒体DNA突变随年龄的增加而积累,达到一定阈值后,可导致细胞能量危机,从而造成机体生理功能的减退引起衰老。

4 线粒体DNA突变在线粒体功能下降和衰老中的作用

1989年Linnane等提出的线粒体衰老学说认为mtDNA由于线粒体的结构特点容易受到自由基的攻击,引发 mtDNA的氧化损伤,导致 mtDNA突变。mtDNA的突变进一步导致线粒体呼吸链电子传递泄漏,使自由基生成增加,进而导致 mtDNA突变增加,以致形成恶性循环。Linnane等认为这种恶性循环导致衰老时生理功能衰退,而 mtDNA突变在其中起到核心的作用。Kovalenko〔27〕等人采用 KL-PCR扩增老年受试者三角肌mtDNA全长,来评估mtDNA的完整性。结果显示突变广泛发生,90岁受试者肌肉组织中只有不到 5%的 mtDNA仍是完整的,大部分mtDNA都存在着缺失突变或 mtDNA的重排。他们认为 mtDNA严重损伤必将影响线粒体蛋白质的合成能力。Michikawa〔28〕等人的研究为“衰老的线粒体理论”提供了有力的证据。他们发现 mtDNA突变随年龄而积累,而且突变主要发生在控制线粒体基因组复制到 D环区。研究发现老年 mtDNA D环区存在高频的点突变,而年轻人则没有。这些突变可能导致与衰老有关的损伤作用的自由基产生增多,导致线粒体能力产生不足。加速 mtDNA的突变率会导致机体的过早衰老,同时会伴随线粒体功能的丧失——衰老发生的主要因素〔29〕。

总之,线粒体在衰老中的作用毋庸置疑,但是否因 mtDNA突变引起线粒体衰老还存在争议,而且该机制还不清楚。此外,mtDNA的缺失和点突变、重排等达到什么样的临界阈值影响线粒体的功能?mtDNA缺失对线粒体呼吸链电子传递复合体的活性随增龄而起多大的作用?机体自身的衰老过程对线粒体呼吸链电子传递有多大程度的影响?这些值得探讨的问题将有助于对 mtDNA在衰老中的作用机制,以及在运动延缓衰老中的有更深刻的理解。

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