绞股蓝总皂苷对肝细胞低密度脂蛋白受体表达的影响

王亚利，范春雷，窦晓兵

(浙江中医药大学生命科学学院，浙江杭州 310053)

血管疾病的主要危险因子之一。低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor，LDL-R)介导的细胞内吞作用在低密度脂蛋白(LDL)的代谢过程中起着重要作用。现代研究表明，许多药物具有降血脂作用，如绞股蓝总皂苷［1］、姜黄素［2］、黄连素［3］、多廿醇［4］等。本文研究旨在用不同浓度的绞股蓝总皂苷干预培养HepG2细胞系来分析细胞LDL受体的功能活性。

1 材料与方法

1.1 材料 肝细胞HepG2，购自中科院细胞库;绞股蓝总皂苷，安徽甙尔塔天然有机化合物信息中心提供;DiI-LDL，本实验室制备［5］。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT法检测绞股蓝总皂苷对HepG2细胞增殖活力的影响 用体积分数0.1 FBS的DMEM培养液培养的HepG2细胞以1.0 ×104/孔接种于 96 孔板，每孔 100 μl，加入不同剂量的绞股蓝总皂苷，终浓度分别为 1、2、5、10、20、30、40、50、70 μmol·L－1。空白对照组不加药。每组 6 复孔，培养48 h;加入 MTT 孵育，4 h 后加入 DMSO 150 μl，震荡10 min，以无细胞空白孔为零点，在波长570 nm处检测OD值。

1.2.2 绞股蓝总皂苷对肝细胞HepG2LDLR基因表达的影响 实验设3个给药组，一个空白对照组，一个无脂血清(LPDS)阳性对照组，一个阴性抑制对照组。给药组加入含绞股蓝总皂苷的体积分数0.1 FBS的DMEM培养液，使其终浓度分别达到5、10、20 mg·L－1。空白对照组不加绞股蓝总皂苷培养液，阳性对照组分别用体积分数0.1的LPDS和20 μmol·L－1的姜黄素;而阴性对照组用 10 mg·L－1的 25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol，25-HC)。其它步骤与给药组相同。操作如下:① 按上述分组培养肝癌细胞HepG2及分别加药继续培养48 h;②倒掉培养液，各加入D-Hanks洗液，轻轻摇晃培养板，洗涤细胞;③ 加DiI-LDL，终浓度至20 mg·L－1，37℃孵育 4 h，再置4℃，30 min;④ 充分洗涤残余DiI;⑤荧光显微镜和流式细胞仪进行定性定量分析。

2 结果

2.1 绞股蓝总皂苷对HepG2细胞增殖活力的影响 不同浓度的绞股蓝总皂苷与HepG2细胞共培养2 d后，用MTT法测定。结果表明70 mg·L－1浓度内的绞股蓝总皂苷对HepG2细胞增殖活性无影响。

2.2 绞股蓝总皂苷对肝细胞HepG2LDL-R基因表达的影响 荧光显微镜检测结果表明，5、10和20 mg·L－1不同浓度的绞股蓝总皂苷以及阳性对照组LPDS和姜黄素均增加HepG2细胞LDL-R的表达。阴性抑制对照组25-HC则抑制HepG2细胞LDL-R的表达。

流式细胞仪定量分析结果表明，和对照组相比，5、10和20 mg·L－1不同浓度的绞股蓝总皂苷对增加HepG2细胞LDL-R表达的作用明显，各组的DiI荧光几何平均数分别为26.6、32.6、45.6;空白对照组为21.9;阳性对照组体积分数0.1 LPDS 及 20 μmol·L－1姜黄素分别为 41.4、34.2;阴性对照组10 mg·L－125-HC为3.8。阳性对照组及绞股蓝总皂苷均增加HepG2细胞LDL-R的表达;阴性对照组则抑制了HepG2细胞LDL-R的表达。

3 讨论

肝脏是血浆LDL-C代谢的主要器官。因此，本文研究中，以肝细胞系HepG2为材料，研究了绞股蓝总皂苷对LDLR表达的影响。中药成分可能会影响培养细胞正常生长。MTT实验表明70 mg·L－1以内的绞股蓝总皂苷对HepG2细胞增殖活性无明显影响。

LDL作为LDL-R的配体，可与细胞LDL-R特异性结合，并可通过受体介导的内吞作用进入细胞。本文用荧光试剂DiI标记LDL，可作为荧光探针检测细胞LDL-R的活性。结果表明5、10和20 mg·L－1不同浓度的绞股蓝总皂苷组及两个阳性组LPDS和姜黄素均促进了LDL-R的表达。阴性抑制对照组25-HC中LDL-R的表达则被明显抑制。说明实验检测的目标蛋白准确。总之，上调LDL-R的基因表达是绞股蓝总皂苷降血脂和抗动脉粥样硬化的作用机制之一。

［1］ 周传林，刘延才，苏怀玲.绞股蓝总甙治疗原发性高脂血症54例报告［J］.山东医药，2003，43(16):65.

［1］ Zhou C L，Liu Y C，Su H L.Gypenosides treatment of primary hyperlipidemia report of 54 cases［J］.Shandong Pharm，2003，43(16):65.

［2］ Chunlei F，Xingde W，Ying Q，et al.Effect of curcumin on the expression of LDL receptor in mouse macrophages［J］.J Ethnopharmacol，2006，105(1 －2):251 －4.

［3］ Weijia K，Jing W，Parveen A，et al.Berberine is a novel cholesterol-loweringdrug working through a unique mechanism distinct from statins［J］.Nat Med，2004，10:1344 －51.

［4］ 何凤英，庞伟毅，陆继培，韦小敏.多廿醇对人单核细胞低密度脂蛋白受体活性的影响［J］.中国药理学通报，2009，7:946－8.

［4］ He F Y，Pang W Y，Lu J P，Wei X M.Effect of policosanol on activity of LDL-R［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，7:946 －8.

［5］ 窦晓兵，范春雷，胡林峰，等.胶体金－荧光素双标配体法研究细胞低密度脂蛋白受体的功能［J］.中国药学杂志，2007，42(10):729－32.

［5］ Dou X B，Fan C L，Hu L F，et al.Colloidal gold-fluorescein pairs of HCG study of LDL-R function of cells［J］.Chin Pharm J，2007，42(10):729－32.