哮喘小鼠肺组织Rho、ROCK信号通路与气道炎症及选择性拮抗剂Y-27632的干预①

项蔷薇 李海静 罗运春 王 强 朱妍艳 李昌崇

（温州医学院附属育英儿童医院呼吸科浙江省小儿呼吸疾病诊疗中心,温州 315000）

哮喘小鼠肺组织Rho、ROCK信号通路与气道炎症及选择性拮抗剂Y-27632的干预①

项蔷薇 李海静 罗运春②王 强 朱妍艳 李昌崇

（温州医学院附属育英儿童医院呼吸科浙江省小儿呼吸疾病诊疗中心,温州 315000）

Rho/Rho激酶[又名Rho蛋白相关卷曲螺旋激酶（Rho-associated coiled-coil formingkinase,ROCK）]信号通路是机体各组织细胞普遍存在的一条信号转导通路,它伴随多种炎症介质和细胞因子受体后耦联机制而激活,且可能整合于这些炎症因子的后效应中,介导疾病的病理生理过程。国外有研究显示哮喘动物模型中存在Rho/ROCK信号通路关键分子的异常表达与活化,可能是导致哮喘气道炎症和气道高反应的重要原因[1,2]。故本研究通过制备哮喘小鼠模型,并应用ROCKⅡ特异性拮抗剂Y-27632进行干预,探讨Rho/ROCK信号通路对哮喘小鼠气道炎症的调控作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与分组 清洁级雄性BALB/c小鼠39只（订购40只,运输途中丢失1只）,4～6周龄,体重16～20克（上海斯莱克实验动物有限责任公司提供）,随机分为4组:A组（对照组,n=9）,B组（哮喘模型组,n=10）,C组（地塞米松干预组,n=10）,D组（Y-27632干预组）。模型制作参照本学科方法[3]并稍作改进:第1和第14天腹腔注射0.1 m l含1%OVA的Al（OH）3凝胶致敏;第25天开始使用空气压缩雾化器向置于密闭有机玻璃容器内的小鼠喷雾1%OVA,每次30分钟,连续定时激发1周。对照组致敏与激发均以生理盐水代替;Y-27632干预组于每次激发前1小时腹腔注射Y-27632溶液0.1m l（4mg/kg）[4];地塞米松干预组每次激发前1小时按0.5mg/kg腹腔注射地塞米松溶液0.1m l。

1.2 主要试剂 OVA、地塞米松粉剂,购自美国Sigma公司;Al（OH）3自行配制;TNF-α、ELISA 试剂盒

购于深圳晶美生物工程有限公司;山羊抗小鼠ROCKⅡ一抗、免疫组化二抗试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司;Trizol抽提试剂系美国Invitrogen公司产品;RT-PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司;Y-27632购于美国Biomol公司。

1.3 血、BALF标本留取和细胞计数 眼球动脉取血,处死小鼠,作血涂片,余血4℃静置2小时,2 000 r/mim离心15分钟,吸取血清分装保存于-80℃。打开胸腔,暴露肺组织,夹闭左肺门,用PBS缓冲液1ml于气管插管处注入,反复抽吸3次,回收率约80%,2 000 r/mim离心15分钟,取上清液-80℃保存。BALF沉渣用1m lPBS液重悬,取一滴滴于玻片上作沉渣涂片。余液用枪头抽取100μl至细胞计数板,低倍镜计四角的四大方格中白细胞总数。按下式计算细胞总数:白细胞数/L=（四大方格内白细胞总数*109）/20。血涂片及BALF沉渣涂片自然晾干后作瑞氏染色。高倍镜下对白细胞作细胞分类计数并计算嗜酸细胞百分比。

1.4 肺组织标本留取、光镜制作与观察 剪切左肺肺门中下肺段,大小约 3mm×3mm×3mm,4%多聚甲醛固定4～6小时,入70%乙醇,送病理科进行石蜡包埋。石蜡包埋后制片,切片厚4μm,常规HE染色,观察支气管及血管周围的炎症细胞浸润情况及气道粘膜充血等改变。左肺门中上段肺组织迅速置于液氮,-80℃保存,用于检测mRNA。

1.5 ELISA 法检测血、BALF中TNF-α浓度 应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（Sandwich ELISA）法检测血、BALF中TNF-α浓度,实验过程参照试剂说明书进行。

1.6 免疫组化SABC法测肺组织中ROCK-Ⅱ蛋白表达 按试剂盒操作说明进行,一抗工作浓度为1∶200,阳性结果呈棕黄色。每张切片随机选择3～5个高倍镜下支气管视野（×400）,应用Image-Pro Plus图像分析软件测定阳性部位的平均吸光度（Mean optical density,MOD）,计算10个MOD值的平均值作为该片的MOD值,MOD值越大,蛋白含量越多。

1.7 RT-PCR法测肺组织RhoA、ROCK-ⅡmRNA表达 按试剂说明书进行操作。引物序列RhoA:Sense 5'-3'AGCCTCATGCGGTTAATTTG,Antisense 5'-3'TCTTTGAATTAGCGCCTGGT,长度 247 bp。ROCK ⅡSense 5'-3'GACCTTCCCGATTCCTAA,Antisense 5'-3'TCTCATAGTCGCCTTTC,长度 427 bp。GAPDH:Sense 5'-3'AGTATGACTCCACTCACGGCAA,Antisense 5'-3'TCTCGCTCCTGGAAGATGGT,长度 100 bp。TRIZOL一步法抽提肺组织总RNA,紫外分光光度计测定RNA含量。根据试剂盒说明逐一加入试剂及1μl总 RNA,反应总体积 20μl。逆转录条件:65℃1分钟→30℃5分钟→65℃30分钟→98℃5分钟→5℃5分钟。取2μl逆转录产物行PCR反应,反应体系20μl。PCR扩增条件:94℃预变性3分钟;94℃30秒变性,54℃（RhoA及GAPDH）或55℃（ROCKⅡ）30秒复性,72℃1分钟延伸,共35个循环;后延伸72℃5分钟。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳。FR-980生物电泳图像分析系统获取凝胶图像,SmartView软件测定产物光密度值（A值）,用目的条带产物光密度值与内参照GAPDH扩增带的A值之比表示组织中目的基因mRNA的含量。

1.8 统计学处理 全部数据经SPSS11.0统计软件进行分析,数据以±s表示,多组比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐者用LSD检验,方差不齐者用Dunnett'T3检验,两变量的相关采用直线相关法分析。

2 结果

2.1 各组小鼠症状比较 在激发阶段,B组小鼠表现为烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐和二便失禁等症状,严重者呼吸减慢或节律不齐,动作迟缓或俯伏不动、四肢瘫痪,反应迟钝甚至瘫痪;C、D组也出现上述表现,程度较为减轻;A组无上述症状。

2.2 各组小鼠细胞总数、分类计数和TNF-α浓度细胞总数及分类计数结果:模型组（B组）BALF中细胞总数[（4.7±2.83）×109]、BALF及外周血EOS百分比[分别为（8.9±4.38）%,（5.60±2.80）%]均显著高于正常对照组（A组）[分别为（0.38±0.52）×109,（0.11±0.33）%,0,P＜0.01];C组[分别为（2.4±1.35）×109,（6.15±2.94）%,（3.10±2.23）%]、D组[分别为（3.87±2.95）×109,（5.51±3.86）%,（2.08±1.68）%]显著低于B组,但高于A组（P＜0.05或P＜0.01）。

ELISA结果:哮喘组小鼠血清及BALF TNF-α浓度分别为（33.02±19.15）pg/m l,（322.76±112.61）pg/ml,均高于对照组[分别为（4.81±2.08）pg/m l,（94.87±32.51）pg/ml,P＜0.01],BALF中TNF-α浓度C组[分别为（13.00±5.75）pg/ml,（162.74±40.15）pg/ml]、D 组[分别为（22.214±12.616）pg/ml,（212.414±115.952）pg/ml]明显比B组低 （P＜0.01）,血清含量D组与B组差别无显著性。

2.3 各组小鼠肺组织病理学改变 哮喘组小鼠肺组织HE染色切片显示肺内支气管粘膜下、肺内支气管及血管周围炎性细胞浸润（包括EOS、中性粒细胞、淋巴细胞）,粘膜下水肿,粘液腺增生,管腔内可见炎性细胞渗出和分泌物,支气管内可见粘液栓,支气管壁略显增厚,基底膜轻度增厚且不规则,细支气管平滑肌轻度肥大。对照组小鼠肺组织结构完整,各级支气管腔规则,粘膜上皮未见脱落,支气管及血管周围未见炎症细胞浸润,细支气管平滑肌未出现增殖等情况。Y-27632干预组及地塞米松干预组基本相似,炎性细胞浸润等病理改变同哮喘组比较明显减轻,但未完全消失。

2.4 各组小鼠肺组织RhoA、ROCK-Ⅱ表达情况 免疫组化结果:ROCK-Ⅱ蛋白表达于胞核,主要见于支气管上皮细胞及散在的炎性细胞。ROCK-Ⅱ蛋白免疫组化染色各组均有强阳性表达。数值以吸光度（MOD）来表示,哮喘组（0.45±0.05）与对照组（0.33±0.02）比较有显著性差异（P＜0.01）,地塞米松干预组（0.37±0.03）及Y-27632干预组（0.374±0.025）ROCK-Ⅱ蛋白表达显著低于哮喘组（P＜0.05）。

RT-PCR结果:组织中目的基因mRNA的含量用目的条带产物光密度值与内参照GAPDH扩增带的光密度值之比表示。RhoA、ROCKⅡmRNA表达呈明显的一致性:B组 RhoA mRNA（5.01±1.22）及ROCKⅡmRNA（7.45±1.43）均明显高于A组（分别为3.29±0.74,2.72±0.73）（P＜0.05或P＜0.01）,C组（分别为 4.45±0.80,5.70±0.90）、D组（分别为3.851±0.560,5.06±1.28）介于A组和B组之间（P＜0.05或P＜0.01）。

3 讨论

Rho/ROCK信号通路主要通过调节肌球蛋白轻链的磷酸化,从而在调控细胞的动态改变中起着重要作用。研究发现大鼠气道高反应模型支气管平滑肌RhoAmRNA表达的明显增加,并伴有Rho蛋白水平的上调与膜转位的增加,而这一系列反应均能被Rho拮抗剂C3外毒素所阻断,提示其可能通过改变支气管平滑肌的功能而参与哮喘的发病过程[5,6]。试验证明给卵白蛋白激发和致敏的小鼠鼻内给ROCKⅡ选择性阻断剂Y-27632后小鼠BALF液中嗜酸细胞及炎症细胞数量呈剂量依赖性方式减少,且其受体拮抗剂Y-27632能抑制嗜酸性细胞过氧化物的产生[7-9]。此外,还有报道显示Eotaxin诱导的嗜酸细胞化学趋化性能被ROCK选择性阻断剂Y-27632和Rho抑制剂C3外毒素所抑制,下调哮喘患者和正常人外周血T细胞所介导的IFN-γ和lL-2的分泌[10]。证明Rho/ROCK信号通路在炎症介质的生物活性如嗜酸细胞的生物学活性、炎症介质的趋化、迁移和粘附过程中活性的调节和干预中均起到重要作用。

本研究发现,哮喘组小鼠肺组织RhoA及ROCKⅡ的表达均较对照组明显升高,气道上皮细胞是其主要来源,证实哮喘小鼠气道内存在Rho/ROCK的表达异常。哮喘组小鼠症状及肺组织病理学改变明显,且有明显的嗜酸细胞增多,Y-27632干预组小鼠哮喘组小鼠症状及病理学改变明显减轻,证实其有减轻哮喘炎症的作用。BALF中炎症细胞数量增多,其中EOS占有相当比例,并伴随外周血EOS百分比增高,Y-27632干预组小鼠BALF细胞总数和嗜酸细胞百分比均较哮喘组有明显下降,证明该通路系通过调节嗜酸细胞的趋化性而参与哮喘的发病过程。TNF-α是炎症过程中最早出现的细胞因子之一,在启动哮喘气道炎症并使其持续存在中起关键作用。本实验发现哮喘组小鼠血清及BALF TNF-α的浓度较对照组明显增高,证明其能介导炎性因子的分泌,Y-27632干预组小鼠血清及BALF TNF-α的浓度较哮喘组有明显下降,证明ROCKⅡ特异性受体拮抗剂Y-27632能通过降低炎性因子的分泌从而发挥抗炎作用。糖皮质激素是目前治疗哮喘的最主要药物,本实验发现地塞米松治疗组小鼠肺组织 RhoA及ROCKⅡ表达明显减少;该组气道炎症表现较哮喘组明显减轻;BALF和血清中EOS%、TNF-α浓度也较哮喘组有明显下降,证实糖皮质激素早期干预可以抑制RhoA、ROCKⅡ的表达,减轻哮喘气道炎症。因此抑制RhoA、ROCKⅡ的表达很有可能是糖皮质激素治疗哮喘并减轻气道炎症的作用机理之一。

1 Hashimoto T,Yamashita M,Ohata Hetal.Lysophosphatidic acid enhances in vivo infiltration and activation of guinea pig eosinophils and neutrophils via a Rho/Rho-associated protein kinase-mediated pathway[J].JPharmacol Sci,2003;91（1）:8-14.

2 AiharaM,DobashiK,Iizuka Ketal.Effectof Y-27632 on release of cytokines from peripheral T cells in asthmatic patients and normal subjects[J].Int Immunopharmacol,2004;4（4）:557-561.

3 李昌崇,张维溪,陈小芳etal.巨噬细胞炎性蛋白1α及其mRNA在哮喘小鼠气道炎症中的作用[J].中华儿科杂志,2004;42（2）:90-93.

4 Iizuka K,Shimizu Y,Tsukagoshi Hetal.Evaluation of Y-27632,a rhokinase inhibitor,asa bronchodilator in guinea pigs[J].Eur JPharmacol,2000;406（2）:273-279.

5 Chiba Y,SakaiH,MisawaM.Augmented acetylcholine-induced translocation of RhoA in bronchial smoothmuscle from antigen-induced airwayhyperresponsive rats[J].Br JPharmacol,2001;133（6）:886-890.

6 Chiba Y,Sakai H,Wachi Hetal.Upregulation of rhoA mRNA in bronchial smooth muscle of antigen-induced airway hyperresponsive rats[J].JSmooth Musc le Res,2003;39（6）:221-228.

7 Hashimoto T,Yamashita M,Ohata Hetal.Lysophosphatidic acid enhances in vivo infiltration and activation of guinea pig eosinophils and neutrophils via a Rho/Rho-associated protein kinase-mediated pathway[12].JPharmacol Sci,2003;91（1）:8-14.

8 Schaafsma D,bos IS,Zuidhof A Betal.The inhaled Rho kinase inhibitor Y-27632 protectsagainst allergen-induced acute bronchoconstirction,airway hyperresponsiveness and inflammation[J].Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol,2008;295:L214-L219.

9 AdachiT,Vita R,SannoheSetal.The functional role of rho and rho-associated coiled-coil form ing protein kinase in eotaxin signaling of eosinophils[J].J Immunol,2001;167（8）:4609-4615.

10 AiharaM,DobashiK,Iizuka Ketal.Effectof Y-27632 on releaseof cytokines from peripheral T cells in asthmatic patients and normalsubjects[J].Int Immunopharmacol,2004;4（4）:557-561.

[收稿2010-04-21 修回2010-08-11]

（编辑 张晓舟）

R562.25

A

1000-484X（2010）12-1124-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.015

①本文为浙江省自然科学基金项目（No.Y207462）

②通讯作者,E-mail:luoyunchun501@163.com

项蔷薇（1980年-）,女,硕士,住院医师,主要从事小儿呼吸系统和免疫疾病研究。