兔在体心脏缺血再灌注模型的制作方法的改进

薛 枫,杨向军,李 勋,韩莲花,王海鹏,郑冬冬

(苏州大学附属第一医院,苏州 215006)

技术方法

兔在体心脏缺血再灌注模型的制作方法的改进

薛 枫,杨向军,李 勋,韩莲花,王海鹏,郑冬冬

(苏州大学附属第一医院,苏州 215006)

目的建立兔在体心脏缺血再灌注模型的新方法。方法40只新西兰大白兔随机分为缺血再灌注组(25只),假手术组(15只)。缺血再灌注组采用“二线二结”法结扎心脏左前降支 30 min,然后恢复心肌灌注 3 h;假手术组仅将线从左前降支周围心肌中穿过,但并不结扎。实验中连续描记心电图。两组分别于结扎 (穿线)前和再灌注 (穿线)后 1 h从股静脉取血 1 mL测定血清肌钙蛋白。实验结束时取心肌行 2,3,5-氯化三苯基四氮唑和苏木精-伊红染色。结果缺血再灌注组心电图存在 ST-T的动态演变,再灌注 1 h后血清肌钙蛋白浓度明显高于术前 (0.47±0.35 vs.0.33±0.31,P=0.002)。两种染色方法均证明存在心肌坏死。结论“二线二结”法能够既方便又成功地建立兔在体心脏缺血再灌注模型。

兔;模型,动物;在体心脏;缺血再灌注

当急性心肌梗死发生后,早期成功地运用溶栓治疗、经皮冠状动脉成形术 (PCI)或急诊冠状动脉搭桥术(CABG)可以使心肌得到再灌注,从而减少坏死的心肌面积,改善临床预后。但是研究发现再灌注会加剧心肌细胞的损伤,导致心肌梗死面积增大,再灌注心律失常和无复流现象的发生[1],从而减少了以上治疗所获得的好处。因此如何能减少再灌注损伤的发生已成为目前研究的热点,而建立心脏缺血再灌注的动物模型为研究提供了平台。迄今为止国内外学者已先后以大鼠、兔、犬和猪制作了该模型[2-5],其中大多数为采用心脏灌流装置的体外模型,少部分为制作繁琐的心脏在体模型。本文介绍一种简便的兔在体心脏缺血再灌注模型的制作方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

新西兰大白兔 40只,雌雄不拘,体重 1.8～3.2 kg,由苏州大学实验动物中心提供 [合格证号: SYXK(苏)2007-0035]。其中缺血再灌注组 25只,假手术组 15只。本研究遵循国家实验动物管理条例及国家实验动物管理实施细则。

1.2 实验耗材

RM6240BO型多道生理信号采集处理系统 (成都仪器厂)。ECG-6511型心电图仪 (上海光电医用电子仪器有限公司 )。Eppendorf-5417C型高速离心机(德国艾本德公司)。华利达 HZ-8812S型水浴摇床 (太仓科教器材厂)。Ther mo Scientific Revco超低温冰箱 (美国赛默飞世尔科技公司)。PH计(德国赛多利斯公司)。手术剪 3把,血管钳 4把,持针器 1把,5×12圆针 1枚,8×20三角针 1枚,0号及 4号缝线,弯头镊 1把,刀片 1把,7号注射器针头 4个。2,3,5-氯化三苯基四氮唑 (TTC,Bio Basic Inc.)。3%戊巴比妥钠溶液。生理盐水。磷酸盐缓冲液(25 mg磷酸氢二钠和 0.5 mg磷酸二氢钠溶于 2 L三蒸水中,调节 pH 8.5～8.6)。羊抗兔心脏肌钙蛋白检测试剂盒(ADL公司)。

1.3 模型制作过程

取兔称重后用木制兔盒将其固定,经耳缘静脉缓慢注射 3%戊巴比妥钠溶液(1 mL/kg),待四肢松软、睫毛反射消失后停止注射,将其仰卧固定于手术台。胸部备皮后予皮肤消毒剂安尔碘消毒,沿胸部前正中线做纵形切口,逐层剖开暴露胸骨及胸廓。于第 2肋间用剪刀剪断胸骨,并同时将胸骨与第 2～4肋双侧连接处剪断,除去胸骨后用缝线向两侧牵拉胸廓以扩大手术视野,用眼科小剪刀剪开纵膈胸膜和心包膜暴露心脏。以肺动脉圆锥与左心耳交界处的左冠状静脉主干为标志,于左心耳下方2 mm处进针缝线穿过心肌,深度为 2 mm,宽度为4～5 mm,与左冠状静脉平行放置一根缝线于心脏表面。予肝素钠溶液 (500 U/kg)静脉推注后,将穿过心肌的缝线交叉打一单结并拉紧两端 (假手术组仅穿线不结扎),由助手将结下放置的与左冠状静脉平行的另一根缝线交叉打一活结,通过两个结成功结扎左前降支。其标志为心电图 II导 ST段明显抬高,结扎局部心肌由红色转为暗灰色。30 min后解开活结,通过牵拉该缝线解开结扎左前降支的死结,从而恢复该血管的灌注。

1.4 心电图

将 7号注射器针头扎入兔四肢皮下作为电极,将多道生理信号采集处理系统和心电图仪的电极线与其连接,记录 II导心电图。

1.5 心肌染色

再灌注 3 h后取出心脏,洗净血迹,去除心房和右心室。于 -80℃冷冻 0.5 h后沿左室长轴将左室横切为厚约 2 mm的薄片,将其置于 30 mL 1%TTC溶液 (0.3 g TTC溶于 30 mL磷酸缓冲液)中,于37℃水浴 0.5 h。

1.6 组织形态学观察

心肌再灌注 3 h后剪取心脏,于冠脉穿线处下5 mm处剪取一小块左心室前壁,常规石蜡制片,苏木精-伊红(HE)染色,显微镜观察组织形态学变化。

1.7 血清肌钙蛋白测定

缺血再灌注组分别于结扎前和再灌注 1 h后穿刺股静脉取血 1 mL,假手术组于穿线前和穿线后 1 h取静脉血 1 mL。所有血样均于 2 500 r/min离心10 min取血清于 -80℃保存。收齐标本后按 ADL公司羊抗兔心脏肌钙蛋白检测试剂盒说明书操作测定血清肌钙蛋白。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 心电图

左前降支结扎后 II导联 ST段弓背上抬明显,再灌注后 ST段回落至基线 (图 1)。

2.2 心肌染色

坏死的心肌呈白色,正常心肌染成砖红色 (图2)。

2.3 组织形态学观察

梗死区心肌丧失正常结构,横纹消失,细胞水肿,胞核溶解、消失,并可见炎症细胞浸润 (图 3), (图 2,3见彩插 2)。

2.4 血清肌钙蛋白测定

再灌注 1 h后左前降支结扎者血清肌钙蛋白浓度明显高于术前(0.47±0.35 vs.0.33±0.31,P= 0.002),而假手术组穿线前后无明显变化 (0.26± 0.2 vs.0.3±0.15,P=0.08)。

3 讨论

目前在体制作心脏缺血再灌注模型的方法有开胸结扎冠状动脉和不开胸、应用心导管介入方法封堵左前降支。本研究采用前一方法制作了兔在体心肌缺血再灌注模型。与众多以大鼠为对象的研究相比,兔具有以下优点:⑴作为哺乳动物其心脏生理特性与人类更为相似(6);(2)心脏相对较大便于操作;(3)左右胸腔各自具有独立的胸膜,互不相通。暴露心脏时不需使用呼吸机。多年以来大多数实验采取左侧第 2、3、4肋间切口开胸。但笔者认为该方法存在较高的气胸发生率,易导致兔死亡。而胸骨正中开胸减少了这种风险。

开胸结扎兔冠状动脉通常选择左前降支,但该血管被薄层心肌覆盖,肉眼不能明视,且长短不一,最短者只达心室的上 1/3,最长者长达心尖(7)。故结扎部位亦高,通常选择左心耳尖下方结扎,且进针要有一定深度,结扎时以与左前降支伴行的左冠状静脉为标志。有文章报道(8)结扎左室支造模,该血管为左旋支分支,沿心脏左缘下行,其特点为表浅、粗大,供血范围较大,造模成功率较高。但笔者认为在体模型本身手术视野不大,找寻并结扎左室支难度较大,且如结扎部位偏高则易致兔死亡,故仍推荐结扎左前降支。

缺血再灌注模型不同于心梗模型,结扎血管造成心肌缺血后要迅速恢复血流。目前大多数实验都是通过将结扎血管的缝线两端共穿一细管形成闭环,拉紧缝线用止血钳固定导致心肌缺血,松开钳子则使心肌得到再灌注(9)。该方法对细管的要求较高,太软则不能完全阻断血流,太硬则容易损伤心肌。也有研究者通过剪断该线来实现再灌注。但由于结扎血管的缝线深陷心肌内,故不仅不能立即恢复血流,而且剪线时容易损伤心肌。本研究所采用的“二线二结”法既简单又有效。结扎血管的缝线所打单结本身易松动,但由于单结下第二根线所打活结刚好压在其上方使其其不易松动,从而阻断血流。当轻松解开该活结后,由于该线恰好位于单结下方故将其向上方牵拉可以立即解开该单结,实现心肌再灌注。血清肌钙蛋白测定和心肌染色证明该方法确实造成了心肌缺血坏死。两结均解开后出现的心电图改变说明该方法成功实现了心肌再灌注。“二线二结”法目前未见报道,笔者认为值得推广。

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A NewM ethod to Establish a RabbitM odel of Heart Ischem ia-Reperfusion in Vivo

XUE Feng,YANG Xiang-jun,L IXun,HAN Lian-hua,WANG Hai-peng,ZHENGDong-dong
(The FirstAffiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China)

ObjectiveThis study intended to explore a new method to establish a model of heart ischemiareperfusion in rabbits in vivo。MethodsForty New Zealand white rabbits were randomly divided into two groups: ischemia-reperfusion group(n=25)and sham operation group(n=15).The myocardial ischemia-reperfusion were generated by two sutures and two knots,namely ligating the prox imal 1/3 segment of the left anterior discending artery (LAD)for 30 minutes followed by opening the blood flow for 3 hours.The LAD of rabbits in the sham operation group was exposed but not ligated.Electrocardiography(ECG)was perfor med during the experiment.Blood sample was drawn from the femoral vein to evaluate cardiac troponin I(cTnI)values before operation and after reperfusion in the ischemiareperfusion group.At the end of the test myocardial tissues were taken and stained with 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride(TTC)and HE,respectively。ResultsThere were electrocardiographic ST-T change in the rabbits of ischemiareperfusion group.The cardiac troponin I values in reperfusion stage were significantly higher than the preoprative values (0.47±0.35 vs.0.33±0.31,P=0.002).both the two stainingmethods confirmed that there weremyocardial necrosis in this group。Conclusions The new method of two sutures and two knots as described in this study can conveniently and successfully establish a rabbitmodelof heart ischemia-reperfusion in vivo,and provide a useful tool for related experimental researches.

Rabbits;Models;Establishment;Heart;Ischemia-reperfusion

R-33

A

1671-7856(2010)02-0051-03

2009-11-15

薛枫(1972-),女,主治医师,在读博士研究生,主要从事心血管疾病的诊治。

杨向军,E-mail:szlongman@126.com。