应用RAPD标记技术对树鼩遗传多样性的分析

黎家敏，李海燕，李婧潇，王新兴，孙晓梅，代解杰

（中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，昆明 650118）

树鼩（Tupaia belangeri，tree shrew）在分类学上属哺乳纲，有胎盘类，是一个独立的目，称为攀鼩目（Scandentia），主要分布在热带和亚热带，如东南亚的印度恒河北部、缅甸和越南等地，以及我国云南、广西和海南等地［1］，中国现野生树鼩仅有1个种—中缅树鼩，6个亚种。昆明地区主要分布的是滇西亚种（Tupaia belangeri chinensis）。随着灵长类动物资源的逐渐萎缩和模式生物小型化的发展趋势，树鼩因其特殊的分类地位和体型小，易驯养，繁殖能力强，新陈代谢等生理特征和解剖结构比犬、鼠等动物更接近于非人灵长类动物，以及存在诸多自发性疾病等特性，可以作为某些人类重大疾病研究的动物模型，在医学生物学上已呈现出广泛的应用前景。目前，树鼩已被应用于病毒、神经、免疫、肿瘤和社会生物学的研究［2］，但对其遗传背景研究极少，可供参考的遗传信息匮乏。

Random amplified polymorphie DNA（随机扩增多态性DNA，RAPD）标记是Williams J［3］和Welsh J［4］于1990年研究发明的一种新型遗传标记方法，具有随机引物易得，无需预先知道目的基因组DNA序列，标记数量多，易于操作，高灵敏度，材料用量少等优点［5］。该技术已被广泛应用于物种的鉴定［6］、分类和遗传多样性研究，包括东方田鼠、长爪沙鼠［7］等实验动物［8］。本文通过建立树鼩RAPD标记技术，开展树鼩群体遗传多样性分析，为树鼩的野生动物保护、引种驯化、遗传育种、繁殖和遗传监测提供理论依据和方法。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验所用的树鼩均为本实验室于2007年野外捕捉的中缅树鼩滇西亚种原代，实验随机抽取48只树鼩，分别标记为T1-T48，雌、雄各半。分别对树鼩进行股动脉采血2mL，EDTA-Na2抗凝，-20℃保存备用。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 试剂：RAPD引物及其序列（购自上海生工生物工程技术服务有限公司），见表1，PCR反应试剂盒DRoo1A（Taq酶、dNTP Mixture、10×buffer和6X loading buffer）购于Takara公司，其他实验试剂药品均为实验室常用分析级。

表1 RAPD扩增引物序列及扩增结果Tab.1 The sequences of primers and results of RAPD analysis

1.2.2 主要仪器设备：离心机（Sigma-202MK），PCR和水平电泳仪（Bio-Rad），凝胶自动成像分析仪（Syngene）。

1.3 DNA提取

1.3.1 红细胞裂解：将冻存的2mL树鼩全血于室温解冻后加入15mL离心管中，在加入2～3倍的红细胞裂解液（150μmol/L NH4Cl，10nmol/L KHCO3，1nmol/L Na2EDTA），37℃水浴10min，3 000r/min离心5min，弃掉上清液，重复1次，直至得到纯净的白色细胞。

1.3.2 基因组DNA提取：按酚/氯仿常规方法提取DNA：向白细胞沉淀物加入3mL STE buffer（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA），悬浮混匀，加入10％SDS 300μL，15μL 20mg/mL proteinase K，5μL RNase A混匀，37℃水浴过夜，以充分消化。用等体积1：1酚/氯仿、24：1酚/异戊醇各抽提1次。每次3 000r/min离心10min。将上清液移到新的离心管中，加入1/10的3mol/LNaAc和2倍的无水乙醇，离心沉淀DNA。再用70％乙醇沉淀两次。室温晾干后。加入适量TE缓冲溶液溶解DNA。用紫外分光光度计在A260/A280处测量DNA，当A值为1.8～2.0时，样品进行基因组DNA稀释至20ng/μL，4℃或-20℃保存备用。

1.4 RAPD扩增条件

RAPD反应总体积为25μL，其中2.5μL 10×buffer（Mg2+plus）、2μL dNTP mixture（各2.5mmol/L）、0.25μL Taq酶（5U/μL）、0.25μL引物（20μmol/L）和5μL DNA（约20ng/μL），用无菌双蒸水补齐至25μL。RAPD反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性1min，40℃退火1min，72℃延伸2min，40个循环后，再72℃延伸10min。

1.5 RAPD扩增产物的电泳

PCR产物用2％的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）于90V电压下电泳40min，凝胶置紫外灯下进行拍照。

1.6 数据统计处理

1.6.1 结果记录：分别用“1”和“0”记录某一扩增带的有无，只记录清晰且重复性好的DNA条带，统计得出所有位点的原始矩阵。

1.6.2 多态位点百分率：通过多态位点数/所测位点总数×100％计算多态位点百分率。

1.6.3 个体间遗传相似系数：根据Lynch方法［9］，计算任意两个个体间遗传相似系数（F）：F=2Nxy/（Nx+Ny）；（Nxy一两个个体共享的位点数；Nx—x个体的位点数；Ny—y个体的位点数）任意两个个体间的遗传距离P=1-F。得到群体内所有个体两两之间比较的平均值。

1.6.4 聚类分析：用RAPDistance Package Version 1.04软件，构建树鼩48只个体的Neighbor-Joining（NJ）系统树［10］。

1.6.5 群体遗传多态度参考Wachira等［11］的公式，用Popgene 1.32软件进行Shannon多样性指数的相关计算：

（1）各群体遗传多态度（H0）H0=-Xiln（Xi/n）（Xi为位点i在某一群体中出现的频率，n为此群体检测到的位点总数）；

（2）平均群体内的遗传多态度Hpop）Hpop=H0/n（n为所研究的群体数）；

（3）所研究种类n个群体的遗传多态度总量（Hsp）Hsp=-X（X为n个群体的综合表型频率）。

2 结果

2.1 RAPD扩增结果

经对40条随机引物的筛选，优选出20条扩增重复性好、条带清晰、特异性强的RAPD引物（表1）。应用筛选出的引物对48只树鼩基因组DNA进行了RAPD分析。20条随机引物及其多态性结果见表1和图1。实验结果共产生113个条带，各引物检测到的RAPD位点数在3～8之间，平均每个引物产生5.65个位点。其中，检测到的多态位点69个，多态位点比率为61.1％.

2.2 遗传距离

48只树鼩进行RAPD扩增得到的遗传相似系数介于0.73～0.91之间，平均为0.8307，个体间遗传距离在0.09～0.27之间，平均遗传距离为0.1693。这表明个体之间差异很大（表2）。

2.3 雌、雄群体遗传多样性

用Shannon多样性指数量化中缅树鼩滇西亚种雌、雄群体遗传多样性（表3），树鼩雌、雄群体平均遗传多态度（Hpop）为0.1667，雄性群体的遗传多态度（H0）为0.1864，略高于雌性群体的0.1470。由Hpop/Hsp比值可见，引物S37和S12分别检测出群体内最大和最小的遗传变异分别为0.6286和0.1208。群体内的遗传变异均值为0.4829。而雌、雄群体间的差异（即1-Hpop/Hsp值），平均为0.5171。因此，有48.29％的遗传变异是在群体内检测到的，而其余部分（51.71％）遗传变异存在于雌雄群体间。

注：T1-T12分别代表12只树鼩基因组DNA，C为空白对照，M1为DNA分子量标记DL5，000（Takara），M2为DNA分子量标记 DNA MarkerⅢ（TIANGEN）.图1 部分树鼩个体的RAPD产物电泳图谱Note：Lane T1 to T12 represent 12 tree shrew individuals，respectively；C：Negative control；LanesM1 andM2 representDNAmolecularweight markerDL5，000（Takara）and DNA markerⅢ（Tiangen），respectively.Fig.1 Electrophoretogram of RAPD fragments produced by S7，S38，S86 and S151 pr imers in some tree shrew individuals

2.4 聚类分析

对20条引物扩增所产生的RAPD数据进行聚类分析得到Neighbor-Joining（NJ）系统树（图2）。由图2可知，T15、T33和T47号树鼩个体聚类成一大类，其余45只树鼩个体聚成另一大类。此外，48只树鼩群体中雌、雄个体呈相互交叉现象。

3 讨论

本研究所使用的树鼩均为野外捕捉于昆明郊区的中缅树鼩滇西亚种的成年树鼩。野生树鼩的运动能力强，活动范围大，资源丰富，在交配时可形成一雄一雌或一雄多雌的配偶群结构。该研究利用RAPD技术对中缅树鼩滇西亚种的48只个体进行分析，20条扩增效果理想的引物共检测到113个RAPD位点，其中多态性位点为69个，占整个研究群体的61.1％，而一些濒危物种如银杉（C.argyrophylla）仅为32.08％［12］。实验结果表明，所研究树鼩群体的遗传多样性较高，也符合树鼩来自野外、群体遗传结构比较复杂，个体间的遗传差异较大的特点。其遗传多样性较高，可能是由于野外生活的树鼩活动范围较大，种群数量大，雌、雄个体随机交配机会增多，基因流频繁的原因。

个体间遗传相似系数F是衡量个体间遗传变异程度的可靠参数，个体间共有的扩增片段越多，F值就越大，表明个体间的亲缘关系越近，遗传变异越小［13］。从树鼩RAPD结果分析可见，不同个体间的遗传相似系数介于0.73～0.91之间，平均为0.8307；群体内个体间的遗传距离平均为0.1693，远高于濒危的滇金丝猴个体间遗传距离的0.051［14］和一些水生生物如中国黄、渤海沿岸的对吓（Penaeus chinensis）群的0.0941［15］，但低于龟类动物种群个体间的平均遗传距离0.324±0.0631［16］。结果提示，本树鼩种群的遗传结构较复杂，多态性较高，可有利于树鼩在逐步实现实验动物化过程中基础种群的建立，驯化和选育。

通过Shannon多样性指数结果分析可见，树鼩

种群有48.29％的遗传变异源于群体内，而51.71％遗传变异在雌、雄群体间产生。此外，聚类分析（NJ系统树）结果发现，雌、雄个体间存在交叉现象。在今后的研究中，有待于扩大引物的筛选，选择更多理想的随机引物进行RAPD分析，并结合STR等其他分子标记，进一步深入开展树鼩遗传学的相关研究。关于树鼩遗传多态性分析，国内外文献报道较少，仅Srikwan［17］和Munshi-South［18］将分离出的6个泰国树鼩（Tupaia glis）和5个马来西亚树鼩（Tupaia spp.）微卫星为位点，并用于树鼩遗传多态性的研究。但因不同地理位置、不同种类的树鼩存在遗传差异性，现有可利用的位点极少以及微卫星分子标记来源困难等问题，经济而实用的RAPD技术可作为分析我国树鼩遗传背景的很好补充。

表2 树鼩个体间遗传相似性和遗传距离（％）Tab.2 Similarity index of fragments and genetic distances among individuals of the tree shrews（％）

表3 树鼩雄、雌群体内和群体间的遗传多样性Tab.3 The genetic diversity with in and between male and female tree shrew populations

图2 树鼩48个个体（T1-T48）间的NJ系统树Fig.2 NJ tree for 48（T1-T48）tree shrew individuals

综上所述，昆明地区所分布的野生中缅树鼩滇西亚种，具有遗传多态性较高、群体遗传结构复杂等特点。虽然RAPD存在显性位点在后代中不能区别是纯合体还是杂合体，容易受其他因素影响造成稳定性和重复性较差等缺点，但其具有操作简单、快捷、成本低而高效等诸多优点。本研究表明，只要优化RAPD反应条件和严格控制其他实验影响因素，RAPD技术完全可用于树鼩种群遗传组成与遗传多样性变化的分析和监测，为今后树鼩种群的种质保护，合理开发利用和选择育种以及实现树鼩实验动物标准化提供一定的理论依据，还可以为深入研究树鼩与其他物种的亲缘关系、居群及种系遗传的分析、构建分子标记连锁图、基因定位和数量性状的选择等提供了一种研究方法。随着该技术在这些领域的拓展应用，必将加深人们对树鼩遗传规律的认识和进一步开展利用树鼩在生物医学领域各个方面的研究。

（致谢：感谢首都医科大学陈振文教授在论文撰写方面的精心指导和帮助。）

［1］徐新平，陈红波，贲昆龙.树鼩在医学生物学中的应用［J］.中国实验动物学报，2005，13（3）：187-190.

［2］秦雪，伊瑶，毕胜利，等.树鼩应用于疾病动物模型的研究进展［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2006，20（2）：97-98.

［3］W illiams JK，Kubelik AR，Livak KJ，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.NuclAcids Res，1990，l8（22）：6531-6535.

［4］Welsh J，MeCleuand McClelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers［J］.NuclAcidsRes，1990，18（24）：7213-7218.

［5］于颖，孟祥盈，王秀利，等.缢蛏遗传多样性的RAPD分析［J］.生物技术通报，2007，（6）：138-140.

［6］Gao S，Hu XZ，CHen ZG，et al.Characterization of marine microplankton communities of Qingdao coastalareasusing randomly amplified polymorphic DNA（RAPD）［J］.Acta Oceanol Sin，2009，28（1）：55-61.

［7］赵太云，李瑞生，董罡，等.4个长爪沙鼠选育群体基因多态性的RAPD分析［J］.中国比较医学杂志，2006，16（9）：564-564

［8］Rehnuma S，Anwara B，Haseena K.Use of RAPD fingerprinting for discriminating two populationsof Hilsa shad（Tenualosa ilishaHam.）from inland rivers of Bangladesh［J］.J Biochem Mol Biol，2003，36（5）：462-467.

［9］Lynch M.The similarity index and DNA fingerprinting［J］.Mol Biol Evol，1990，7（5）：478-484.

［10］NeiM，LiWH.Mathematicalmodel for studying genetic variation in termsof restriction endonucleases［J］.ProNatlAcad SciUSA，1979，76（10）：5269-5273.

［11］Wachira FN，Waugh R，Hackett CA，et a1.Detection of genetic diversity in tea（Camellia sinensis）using RAPD markers［J］.Genome，1995，38（2）：201-210.

［12］汪小全，邹喻苹，张大明，等.银杉遗传多样性的RAPD分析［J］.中国科学（C辑），1996，26（5）：436-441.

［13］王奕华，张士璀，刘振辉.青岛文昌鱼遗传多样性的RAPD分析［J］.海洋水产研究，2004，25（3）：21-27.

［14］兰宏，张文艳.滇金丝猴的随机扩增多态DNA与遗传多样性分析［J］.中国科学（C辑），1996，26（3）：244-249.

［15］Liu P，Kong J，Shi T，et al.RAPD analysis of wild stock of penaeid shrimp（Penaeus chinensis）in the China′s coastalwaters of Huanghai and Bohai Seas［J］.Acta Oceanol Sin，2000，22（5）：88-93.

［16］朱新平，杜合军，周莉，等.乌龟遗传多样性的RAPD分析［J］.水生生物学报，2005，29（2）：167-171.

［17］Srikwan S，Hufford K，Eggert L，et al.Variable microsatellite markers for genotyping tree shrews，Tupaia，and their potential use in genetic studiesof fragmented population［J］.ScienceAsia，2002，28：93-97.

［18］Munshi-South J，Wilkinson GS.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci in Bornean tree shrews（Tupaia spp.）［J］.Mol EcolNotes，2006，6：698-699.