结节性硬化症基因研究发展状态综述

吴贵贤 崔茂荣 张小德 徐跃文 陈 钊 张学刚 李 翔

曲靖市第一人民医院泌尿外科（655000）

结节性硬化症（tuberous sclerosis，TSC）是以错构瘤为主要表现的累及多个系统和器官的常染色体显性遗传性疾病。TSC1和TSC2两个肿瘤抑制基因是该病的致病基因，TSC基因除了通过TSC-Rheb—-TORS6K1/4EBP1途径调节细胞增殖外还参与了细胞黏附、细胞内吞等重要的生物学功能，其功能除了与TSC综合征密切相关外，在其他散发性肿瘤中的作用也受到越来越多的重视。调节细胞的生长和分化、表达产物、TSC 基因具有肿瘤抑制性、TSC蛋白活性的调节等。目前以特异性抑制mTOR为主要作用原理的药物已进入临床开发，TSC基因也有望作为肿瘤发生和治疗研究的新的靶分子。

1 TSC1、TSC2特性

TSC 是以错构瘤为主要表现的累及多个系统和器官的常染色体显性遗传性疾病。TSC1和TSC2两个肿瘤抑制基因是该病的致病基因。TSC基因含有23个外显子，第1、2外显子不具有编码功能，转录产物为相对分子质量为8.6的mRNA，编码相对分子质量为130×103、由1164个氨基酸组成的错构瘤蛋白。TSC2基因含有41个编码外显子和1个无编码意义的引导外显子，转录为相对分子质量为5.5的mRNA，编码相对分子质量为190×103，由1807个氨基酸组成的马铃薯球蛋白（tuberin）。上述两种蛋白可形成一种复合体，参与调节细胞的增殖、生长、黏附及囊泡运输等[1]。Jones等[2]发现80%的TSC患者可以检测到突变，且大部分突变发生在TSC2基因上，约占总突变检出率的82%。姚凤呜等[3]采用直接测序法对2例汉族TSC 患者（一为家系，一为散发）进行突变筛查，结果发现了TSC2基因的1个无义突变c.1372 C＞T（p.R458x）和1个移码突变5238-5255 del 18bpCATCAAGCGGCTCCGCCA。无义突变c.1372 C＞T（p.R458X）发生在TSC2基因第13号外显子上，导致TSC2基因翻译第458位氨基酸蛋白产物时提前出现终止密码子，形成1个截断蛋白。马铃薯球蛋白（tuberin）包含7个功能结构域，从N端到C端依次为：亮氨酸拉链区（1eucine zipper domain，LZD）、CCD1、CCD2、TAD1、GAPD、TAD2、钙调蛋白结合区（calmodulin-binding domain，CaMD）。本突变恰位于马铃薯球蛋白CCD1和CCD2两功能区之间，导致CCD2、TAD1、GAPD、TAD2和CaMD 5个功能结构域的丢失，这是导致该患者临床表型的主要原因。Rose等[4]曾通过单链构象分析法检测到相同的突变，但在中国汉族人中属首次报道。移码突变5238-5255 del 18bp CATCAAGCGGCTCCGCCA 1746 del HIKRLR位于TSC2基因40号外显子上，Beauchamp等[5]曾于1998年报道过此突变，国内也有报道。该突变位于马铃薯球蛋白钙调蛋白结合区CaMD。Noonan等[6]研究显示，CaMD是马铃薯球蛋白调节甾体激素受体所必需的结构，故发生于该区域的突变可能参与了该疾病的发生。TSC是一种表型多样的疾病，Dabora等[7]均曾经对224名TSC患者进行突变检测发现，TSC2基因发生突变的患者其临床表现更严重，较易发生智力发育迟缓、癫痫、面部血管纤维瘤及视网膜错构瘤等。Zhao等[8]对国内报道的20个TSC基因突变报道进行分析，也支持上述观点。姚凤呜等[3]通过聚合酶链反应及DNA直接测序的方法对中国汉族人群中2例TSC患者进行突变检测，发现1个无义突变和1个移码突变，表明TSC2基因突变是中国TSC患者的分子发病机制，为该病患者进行产前诊断及遗传咨询以及进一步的蛋白功能学研究奠定了基础。

2 TSC 的遗传异质性

TSC1 基因定位于第9号染色体长臂上（9q34），与AKI和ABO血型基因有连锁关系，其蛋白产物被称为hamartin[9]，TSC2 基因定位于第16号染色体短臂上（16p13.3），与Ⅰ型多囊肾（PKD）基因近端的DNA标记有连锁，其蛋白产物被称为tuberin。由于TSC有遗传异质性，故由2个不同基因型引起的临床表现是否一致值得进一步研究。在某些情况下，遗传异质性有助于解释诸如多发性神经纤维瘤等临床的不同形式。然而，除了邻近基因缺失综合征，TSC1和TSC2基因异常都可引起所有的TSC并发症，由这2个基因或特异性突变引起的表现型也许有轻微的不同。有证据表明，TSC2突变引起的疾病较TSC1更严重，但这一点仍需要进一步证实[10]。最近有研究发现hamartin和tuberin的细胞内作用途径相同，因此认为两者的临床表现无明显差异[11]。

3 基因的功能

已知TSC 的两个基因都是抑癌基因，它们的功能是调节细胞的生长和分化。当两个基因发生突变时，它们对细胞的生长调节失控，致使肿瘤形成。一些TSC的错构瘤患者显示了杂合性的丢失，TSC患者中9q34或16p13的标记是杂合性的，但在肿瘤中则是纯合性的[12,13]。杂合性的丢失说明TSC患者通过遗传或胚胎早期的基因突变造成1个基因复本的缺失，且仅在以前正常的复本有1个体细胞的突变时才会发病。最近对Eker小鼠（TSC动物模型） 和turbin 蛋白细胞内功能的研究进一步支持了肿瘤抑制假说。Eker小鼠在TSC2基因有一个突变时，可发生显性遗传的肾细胞癌、室管膜下和皮质下错构瘤。重新诱导一个野生型TSC2基因可抑制该模型中肾肿瘤的发展[14]。同源性序列研究发现tuberin和GTP酶激活蛋白GAP3具有部分同源性[15]，已知GTP酶参与细胞生长和分化的调节，因此认为tuberin也许有调节这一活性的作用。

4 TSC的邻近基因缺失

多囊肾在TSC 中较常见，其发病与TSC1和TSC2基因有关。一些多囊肾病发病较早，临床症状较重，多由一个邻近基因缺失所致，同时影响TSC2和PKD1基因[16]。对诊断TSC 的患儿若怀疑合并多囊肾，应进行双肾超声检查。

5 TSC的镶嵌性

TSC2和PKD1邻近基因缺失的患者其临床表现较轻，这是由于他们的邻近基因缺失是体细胞镶嵌体的，即体细胞后天自发的突变。体细胞镶嵌体有两个或多个细胞系，但只有2个等位均发生突变的细胞系，才会导致生长和分化的紊乱。体细胞镶嵌体在伴有或不伴有邻近TSC2-PKD1 综合征的TSC1和TSC2患者都被报道过[17,18]。镶嵌型疾病的病情程度差异很大，有的也可以很严重。一般情况下，如果细胞系的异常被确定在性腺（性腺镶嵌体），那么表现型正常的父母所生子女受影响的危险性就较高，但在TSC 时并不发生这种情况，研究证实父母未受影响养育一个TSC小儿后，下一胎受影响的风险率仅为2%～3%[19]。

6 TSC蛋白的磷酸化调节

当细胞环境发生改变时，tuberin被磷酸化，改变对mTOR的抑制作用。参与tuberin磷酸化的信号通路主要包括PI3K/Akt、ERK/RSK1、LKB1-AMPK等。在有丝分裂期间，PI3K/Akt磷酸化tuberin，降低其GAP活性，负性调节hamartin/tuberin复合体的肿瘤抑制功能[20]。最近发现ERK（extracellular signa1-regulated kinase）活化靶基因RSK1后能够结合并磷酸化tuberin，抑制其功能[21]，ERK也可通过直接磷酸化tuberin特异的氨基酸位点如s664位点，导致hamartin/tuberin解离，大大消弱tuberin抑制mTOR信号、细胞增生和细胞癌性转化的能力，参与肿瘤的形成[22]。此外还存在一个正性调节TSC2的磷酸化机制，LKB1是Peutz-Jeghers综合征中发生突变的肿瘤抑制基因，可以磷酸化细胞内能量状态感受器AMP依赖蛋白激酶（AMP dependent protein kinase，AMPK）进而磷酸化激活tuberin，增强hamartin/tuberin复合体的GAP活性，抑制Rheb依赖的mTOR活性[23]。

7 TSC蛋白的泛素化调节

许多细胞内的蛋白被泛素化降解，其共同特点是存在一个PEST元件，序列研究发现tuberin也存在PEST元件。Benvenuto等[24]发现hamartin与tuberin的结合可使其免受泛素化。hamartin也可被泛素化，但是程度较小，可以通过与tuberin共表达保持稳定。Pam是神经元特异性蛋白，能够调节突触的生长，其末端包含一个与tuberin结合的RING锌指结构域，可能通过该结构域作为E3泛素化连接酶，与tuberin相互作用，调整hamartin/tuberin复合物被泛素化降解的过程[25]。HERC1（HECTdomain and RCC1 domain）属于E1泛素化连接酶，可以与tuberin相互作用，hamartin/tuberin复合体的形成可抑制tuberin与HERC1的相互作用，使tuberin保持稳定[26]。

8 TSC基因与疾病发生

Tuberin和hamartin作为肿瘤抑制因子，杂合性缺失（1oss of heterozygosity，LOH）或二次打击突变常发生在多种与结节性硬化相关的错构瘤或肿瘤中，如淋巴管平滑肌增多症（LAM），脑巨细胞星形细胞瘤和肾脏肿瘤。最近有数据表明，TSC基因LOH或者突变导致蛋白的功能失活可能与一些非TSC疾病相关肿瘤如散发性膀胱癌、卵巢癌、胆囊癌、鼻咽癌、肺腺癌、子宫内膜癌和非小细胞肺癌等有关[27-33]。Jiang等[34]研究了TSC基因在乳腺癌中的表达，结果发现TSC基因mRNA和蛋白水平表达降低，而且TSC基因的低表达与乳腺癌的侵袭性增强和低生存率有关。Wienecke等[35]通过逆转录PCR和免疫印记分析了49例成人、10例儿童非TSC室管膜细胞瘤患者TSC2 mRNA和蛋白表达水平。结果表明存在TSC2表达降低和缺失，但主要针对成人。Kataoka等[36]通过免疫组织化学和逆转录PCR分析了42例胰腺癌患者中tuberin的表达水平，24例（57%）肿瘤标本tuberin表达阴性且TSC2在肿瘤组织中的表达较相应的非肿瘤组织中表达要低。

9 TSC1与TSC2的肿瘤抑制性

根据Knudson 肿瘤抑制基因突变和体细胞二次突变学说（即肿瘤易感性和肿瘤发生学说），TSC错构瘤基因突变的多样性表明TSC基因是一个肿瘤抑制基因。肿瘤抑制基因能够抑制细胞的恶性转化，对正常细胞的增殖起负性调节作用，该基因失活常常表现为一个等位基因缺失和另一个残留等位基因的突变，等位基因缺失就是由肿瘤中常见的染色体区域或片段缺失所致，同时会伴有肿瘤抑制基因相邻区域的杂合性缺失（LOH）。通过LOH分析及检查基因组特定染色体上多态标记，可定位肿瘤抑制基因并能发现新的肿瘤抑制基因的位点。多种形式的TSC1和TSC2等位基因及相邻区域杂合性缺失，与TSC2位点相比，LOH较少发生于TSC1位点上。LOH在TSC1和TSC2位点上的发生率不同，可能是由于在散发患者中，TSC1和TSC2种系突变发生率不同，也可能是由于在2个位点上LOH和小突变（包括小片段缺失或插入、点突变、沉默突变） 相对发生率不同所致。

10 展 望

随着TSC1和TSC2基因的定位及克隆，使人们对TSC 的分子发病机制有了一定的了解，为TSC的基因诊断和治疗创造良好的条件。目前TSC1 和TSC2 基因与肿瘤抑制基因之间的关系需进一步明确，它们的表达产物错构瘤蛋白和马铃薯球蛋白的功能及相互作用尚不清楚，相信随着研究的深入，人类最终能实现TSC 的基因治疗。

[1]Krymskaya VP.Turnour suppressors hamartin and tuberin:intracellular signalling[J].Cell Signal,2003,15(3):729-739.

[2]Jones AC,Shyamsundar MM,Thomas MW,et a1.Comprehensive mutation analysis of TSC1 and TSC2-and phenotypic correlations in150 families with tuberous sclerosis[J].Am Hum Genet,1999,64(5):1305-1315.

[3]姚凤呜,范星,周伏胜.结节性硬化症的基因突变研究[J].中国麻风皮肤病杂志,2008,24(11):861-863.

[4]Rose VM,Au KS,Pollom G,et a1.Germ-Line mosaicism in tuberous sclerosis:how common.[J]Hum Genet,1999,64(4):986-992.

[5]Beauchamp RL,Banwell A,McNamara P,et a1.Exon scanning of the entire TSC2 gene for germline mutations in 40 unrelated patients with tuberous sclerosis[J].Hum Mutat,1998,12(6):408-416.

[6]Noonan DJ,Lou D,Griffith N,et aI.A calmodulin binding site in the tuberous sclerosis 2 gene product is essential for regulation of transcription events and is altered by mutations linked to tuberouss clerosis and lymphangioleiomyomatosis[J].Arch Biochem Biophys, 2002,398(1):132-140.

[7]Dabora SL,Jozwiak S,Franz DN,et a1.Mutational analysis in acohort of 224 tuberous sclerosis patients indicates increased severity of TSC2.compared with TSC1.disease in multiple organs[J].Am Hum Genet,2001,68(3):64-80.

[8]Zhao XY,Yang S,Zhang XJ,et a1.Two novel TSC2 mutations in Chinese patients with tuberous sclerosis complex and a literature review of 20 patients reported in China[J].Br J Dermatol,2006,155(5):1070-1073.

[9]Van SM,Hoogt R,Hermans C,et al .Identification of the tuberous sclerosis gene TSC1 on chromosome 9q34 [J].Science,1997,277(5327):805-808.

[10]Jones AC,Daniells CE,Snell RG,et al .Molecular genetic and phenotypic analysis reveals differences between TSC1 and TSC2 associated familial and sporadic tuberous sclerosis[J].Hum Mol Genet,1997,6(12) :2155-2161.

[11]Nillist M,Slegtenhorsy MA,Goedbloed M,et al.Characterisation of the cytosolic tuberin-hamartin complex,tuberin is a cytosolic chaperone for hamartin[J].J Biol Chem,1999,274(50):35647-35652.

[12]Green A,Johnson P,Yates J .The tuberous sclerosis gene on chromosome 9q34 acts as a growth suppressor[J].Hum Mol Genet,1994,3(10):1833-1834.

[13]Green A,Smith M,Yates JR.Loss of heterozygousity on chromosome 16p13.3 in hamartomas from tuberous sclerosis patients[J].Nat Genet,1994,6(2):193-196.

[14]Kobayashi T,Smith M,Takahash R,et al .Transgenic rescue from embryonic lethality and renal carcinogenesis in the Eker rat model by introduction of a wild-type TSC2 gene [J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(8):3990-3993.

[15]Wienecke R,Konig A,Declue JE.Identification of tuberin,the tuberous sclerosis-2 product.Tuberin possesses specific Rapl GAP activity[J].J Biol Chem,1995,270(27):16409-16414.

[16]Sampson JR,Maheshwar MM,Aspinwall R,et al .Renal cystic disease in tuberous sclerosis : role of the polycystic kidney didease 1 gene[J].Am J Hum Genet,1997,61(4) :843-851.

[17]Kwiatkowska J,Wigowska SJ,Napierala D,et al .Mosaicism in tuberous sclerosis as a potential cause of the failure of molecular diagnosis[J].N Engl J Med,1999,340(9) :703-707.

[18]Verhoef S,Vrtel R,Essen T,et al .Somatic mosaicism and clinical variation in tuberous scerosis complex [J].Lancet,1995,345(8943):202.

[19]Yate JR,BakeL I,Sepp T,et al .Female germline mmosaicism in tuberous sclerosis confirmed by molecular genetic analysis [J].Hum Mol Genet,1997,6(13) :2265-2269.

[20]Inoki K,Li Y,Zhu T,et aL TSC2 is phosphorylated and inhibited by Akt and suppresses mTOR signalling[J].Nat Cell Bid,2002,4(9):648-657.

[21]Ma L,Chen Z,Erdjument-Bromage H,et a1.Phosphorylation and funotional inactivation of TSC2 by Erk implications for tuberous sclerosis and cancer pathogenesis[J].Cell,2005,121(2):179-193.

[22]Ma L,Teruya—Feldstein J,Bonner P,et a1.Identification of S664 TSC2 phosphorylation as a marker for extracellular signalregulated kinase mediated mTOR activation in tuberous sclerosis and human cancer[J].Cancer Res,2007,67(15):7106-7112.

[23]Corradetti MN,Inoki K,Bardeesy N,et a1.Regulation 0f the TSC pathway by LKBl:evidence of a molecular link between tuberous sclerosis complex and Peutz-Jeghers syndrome[J].Genes Dev,2004,18(13):1533-1538.

[24]Benvenuto G,Li S,Browon SJ.et a1.The tuberous sclerosis-l(TSCI)gene product hamartin suppresses cell growth and augments the expression of the TSC2 product tuberin by inhibiting its ubiquitination[J].Oncogene,2000,19(54):6306-6316.

[25]Han S,Wrtt RM,Santos TM,et a1.Pam (Protein associated with Myc)functions as an E3 ubiquitin ligase and regulates TSC/mTOR signaling[J].Cell Signal,2008,20(6):1084-1091.

[26]Chong-Kopera H,Inoki K,Li Y,et al. TSCI stabilizes TSC2 by inhibiting tIle interaction between TSC2 and the HERC1 ubiquitin ligase[J].J Biol Chem,2006,281(13):8313-8316.

[27]Pymar LS,Plattf M,Askham JM,et a1.BIadder tumour derived somatic TSC1 missense mutations cause loss of function via distinct mechanisms[J].Hum Mol Genet,2008,17(13):2006-2017.

[28]Lu KH,Wu W,Dave B,et a1.Loss of tuberous sclerosis complex-2 function and activation of Mammalian target of rapamycin signaling in endometrial carcinoma[J].Clin Cancer Res,2008,14(9):2543-2550.

[29]Okada S,Tsuda H,Takarabe T,et aL Allelotype analysis of common epithelial ovarian cancers with specialreference to comparison between clear eell adenocarcinoma with other histological types[J].Jpn J Cancer Res,2002,93(3):798-806.

[30]Takamochi K,Ogura T,Suzuki K,et a1.Loss of heterozy-gosity on chromosomes 9q and 16p in atypical adenomatous hyperplasia concomitant with adenocarcinoma of the lung[J].Am J Pathol,200l,159(2):l941-1948.

[3l]Takamochi K,Ogura T,Yokose T,et a1.Molecular analysis of the TSCI gene in adenocarcinoma of the lung[J].Lung Cancer,2004,46(4):271-281.

[32]Fang Y,Guan X,Guo Y,et al. Analysis of genetic alterations in primary nasopharyngeal carcinoma by comparative genomie hybridization[J].Gen Chrom Cancer,2001,30(3):254-260..

[33]Nakayama K,Konno M,Kanzaki A,et a1.Allelotype analysis of gallbladder carcinoma associated witll anomalous junction of pancreaticobiliary duct[J].Cancer Lett,2001,166(3):135-141.

[34]Jiang WG,Sampson J,Martin TA,et a1.Tuberin and hamartin are aberrantly expressed and linked to clinical outcome in human breast cancer:the role of promoter methylation of TSC genes[J].Eur J Cancer,2005,11(2):1628-1636.

[35]Wienecke R,Guha A,Maizec JR,et a1.Reduced TSC2 RNA and protein in sporadic astrocytomas and ependymomas[J].Ann Neuro1,1997,42(2):230-235.

[36]Kataoka K,Fujimoto K,Iio D,et al.Expression and prognostic value of tuberous sclerosis complex 2 gene product tuberin in human pancreatic cancer[J].Surgery,2005,138(3):450-455.