核心蛋白多糖基因(DCN)的研究进展

孙加节,张春雷,房兴堂,陈 宏＊,2

(1.徐州师范大学细胞与分子生物学研究所,江苏 徐州 221116;2.西北农林科技大学动物科技学院/陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西 杨凌 712100)

核心蛋白聚糖(decorin,DCN)是一种富含亮氨酸的小分子蛋白多糖,由富含亮氨酸的核心蛋白和一条糖胺聚糖链组成,主要分布在人和动物的主动脉 、肺 、皮肤 、肾脏 、肌腱 、平滑肌 、骨 、软骨 、脐带 、韧带、胎盘及角膜等部位的结缔组织中,属于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分,与胶原纤维紧密相连,又叫 PG-2、PG-Ⅱ、PG-S2、PG-40 或 DS/CS-PGⅡ。由于电镜下显示其在胶原网络中能够修饰胶原纤维,故又称为饰蛋白聚糖[1,2]。1978年,首次由美国国立卫生研究院骨科研究所的Fisher教授分离、纯化[3]。1986年,Krusius等[4]通过提取人胚胎成纤维细胞系IMR290RNA、构建cDNA文库,成功克隆DCN基因并测序鉴定。DCN的核心蛋白可以结合多种细胞因子或生长调节因子,包括转化生长因子β(transforming growth factor,TFG-β)、纤连蛋白(fibronetin,FN)、血栓素结合蛋白(thrombospondin)及DCN胞吞受体等,并且具有多种生物活性,包括调节和控制组织形态发生、细胞分化、运动、增生以及参与胶原纤维的形成等过程。

1 Decorin的分子结构

核心蛋白聚糖(DCN)由一个球形的核心蛋白和一条含硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)/硫酸皮肤素(dermatar sulfate,DS)葡糖胺聚糖侧链(glycosaminoglycans,GAG)组成[3]。DCN基因在人类基因组为双拷贝,定位于12号染色体12q21-q22[5]。其核心蛋白相对分子质量为39 793,以富含10～12个亮氨酸重复序列结构域为主要特征,每个结构域长度约相当于24个氨基酸。人类DCN由359个氨基酸组成的(即包括3个终止密码子 TAA在内共1 080 bp编码),包含了N末端16个氨基酸的信号肽、14个氨基酸的前肽以及329个氨基酸组成的成熟核心蛋白[4],按其作用不同可分为4个功能域(functional domains)[6]。第一功能域包括最开始的N-末端的30个残基,其中分别代表含有16个氨基酸的信号肽(signal peptide)和14个氨基酸的前肽(propeptide)。信号肽可引导新翻译的核心蛋白进入粗面内质网加工结合GAG链并切除信号肽自身,而前肽含有许多酸性氨基酸,它可协助调节单链GAG与第二功能区N-端上的丝氨酸残基结合。GAG侧链连接成熟DCN氨基末端的一个丝氨酸残基处,即为第二功能域的起始,葡糖胺聚糖链连接后与其他的GAG侧链或者另外的核心蛋白发生相互作用,并为血栓素结合蛋白产生一个特异结合位点。GAG侧链结合点紧随的是一个富含半胱氨酸的区域,区域的中心是核心蛋白(core protein),则为第三功能域,其最大特点是在长度上包括24个氨基酸的富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeat,LRRs),亮氨酸的残基定位于 1、4、6、11 和14的LRRs片段中,LRRs基本特性是促进蛋白质之间的结合作用,可与 TGF-β发生结合反应,也是胶原特异性结合位点。第四功能域是位于C-末端的部分,结构特点是包含一个保守的34～41个残基的二硫化物环,还包括胶原纤维和纤连蛋白细胞结合域的结合位点。

2 Decorin的生物合成

人类DCN基因的启动子(promoter)被分为两个确切的区域:约含188个碱基对的近侧区和800个碱基对的远侧区[7]。近侧区包括一个CAAT盒(上游启动子元件)和位于转录起始点处的紧密排列的两个TATA盒(真核生物启动子元件),该区域也包括两个肿瘤坏死因子α(TNF-α)反应成分,DCN基因表达的下调可以被 TNF-α诱导的核蛋白所介导,而后者则可以识别和结合近侧区的TNF-α反应成分。第144～188之间的48个碱基对的区域是与主要转录起始点有关的部分,该区域包含激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)结合位点,AP-1结合位点处有 DCN基因表达的双向调节因子[8]。DCN基因启动子的远侧区包含大量的Cis反应成分(顺式作用元件)及一个AP-1(转录因子)、一个AP-5(转录因子)、两个NF-KB基序(反式作用因子)、TGF-β的负性调节成分等。其中TGF-β的负性调节成分已经在多种蛋白酶的序列中被发现,其功能可能是抑制DCN基因的转录。Borden等[9]观察到用TGF-β处理过的肾小球膜细胞和鼠的肝细胞中的DCN基因的表达被上调。GAG侧链的生物合成在粗面内质网中进行,第二功能域的丝氨酸被木糖转移酶(xylosyltransferase)识别,木糖转移酶又被两个半乳糖残基构成的三糖(trisaccharide)结合,糖醛酸(uronic acid)和半乳糖(galactosamine)共同建构核心结构,该结构可以在不同的水平上被修饰[10]。DCN的来源可以采取以下两种方式:一是从组织中直接提取,二是可以利用DNA重组技术生产基因工程的产品,由于DCN广泛分布于人和动物的各种组织当中,为此从组织中提取天然的DCN有广泛的来源和技术上的可行性,如可以从动物的组织中分离及纯化DCN[11]。目前国内王国华等[12]用二次色谱法分离提取出DCN,曹茂开等[13]用基因克隆技术成功获得DCN。

3 Decorin的研究进展

3.1 Decorin与组织纤维化

组织纤维化是一个复杂的病理过程。它是指组织或器官纤维组织增生,胶原纤维明显增加,包括细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分及量的改变。纤维化形成的关键是ECM的过度沉积,DCN的抗增殖活性能够直接影响纤维化的形成。DCN是与胶原纤维相关的小分子间质性蛋白多糖,主要由皮肤成纤维细胞、肝星状细胞及肾小球系膜细胞等产生,能调节和控制组织形态发生、细胞分化、运动、增殖及胶原纤维的形成等过程,对防止组织和器官的纤维化有重要作用。近年来对于纤维化的诊断和治疗日益集中在分子和基因的水平,Isaka等[14]报道,给大鼠转入DCN cDNA可治疗肾小球肾炎所致的肾纤维化;Sayani等[15]在肥大性瘢痕中用DCN mRNA与TGF-β mRNA原位杂交研究显示,DCN mRNA在组织受到损伤后12个月以内缺乏,而在12～36个月之间有较高的表达,正常组织中却很少表达,可能提示DCN在纤维化的形成中起双向调节作用。Scott等[16]研究发现,增生性瘢痕中DCN含量减少,只有正常组织的25%。DCN核心蛋白结构与Ⅰ型胶原结合,通过GAG侧链之间形成的抗平行的双螺旋结构使胶原分子的侧向装配受限,调节胶原纤维的直径,并保证其正确装配。增生期瘢痕(keloid)中的DCN mRNA表达明显减少,胶原原纤维间的塑形分子结构消失,从而使胶原原纤维的形成和装配失去限制。Neame等[17]在DCN与lumican调节胶原原纤维形成的研究中发现,DCN延迟纤维化初期的进程,并减小纤维的直径,DCN与lumican协同作用比单独作用显示更大的延缓纤维化形成;研究显示lumican并不竞争胶原纤维上DCN的结合位点,而且二者共同作用还增加纤维结构的稳定性。免疫电镜示DCN可大量存在于胶原纤维的附近,通过调整胶原纤维的C-末端,在胶原形成的起始阶段延迟原胶原纤维的组建,使胶原数量减少。Mietz等[18]应用酶联免疫吸附沉淀(ELISA)法在体外培养Tenon′s囊纤维原细胞中加入100 g/L的DCN,发现能减少50%的Ⅰ型胶原纤维和80%的Ⅱ型胶原纤维的含量,并认为在整个实验过程中对纤维原细胞的蛋白质无毒副作用。目前,一些国家已经尝试将提取和人工合成的DCN通过适当的途径用于动物和人体进行抗纤维化的治疗,国内也有用DCN干预纤维化的成功实验报道。相信以后DCN在这个领域的研究会更加成为热点。

3.2 Decorin与肿瘤

近年研究发现DCN是多种细胞因子及生长因子的配体,参与细胞信息转导和生长调控,特别是在肿瘤细胞的生长转移过程中发挥重要作用,而成为肿瘤研究中的热点。Santra等[19]给培养的结肠癌细胞转染decorin cDNA,观察到软琼脂培养基上形成的肿瘤体积明显变小。并且,这种细胞生长抑制可以被decorin基因的反义寡核苷酸逆转。Nash等[20]用两种卵巢癌细胞株SKOV3和2 774体外培养,培养液中加入150～400 mg/mL浓度的Decorin,发现其对癌细胞生长有明显抑制作用,并且这种抑制和卡铂有协同效应。加入Decorin到肺鳞癌细胞株A431培养液,发现Decorin同样可以使肺癌细胞生长停滞,并通过流式细胞方法检测证明肿瘤细胞生长停滞在 G1期[21]。Koninger等[22]也发现Decorin可以通过细胞生长周期的G1-S关卡点,阻滞、延缓胰腺癌细胞增殖。胶质瘤细胞株分别进行Lewis大鼠颅内接种,结果发现表达decorin基因的CNS21细胞株接种的大鼠,体内瘤体生长减缓,其荷瘤生存期明显延长,两组比较有显著性差异[23]。Stander等[24]用三种其他神经胶质瘤细胞株LN218、LN2229及 T98G转染decorin基因后进行动物体内接种,发现转染decorin基因后的肿瘤细胞株在体内形成的瘤体明显减小,并且瘤体周围有明显的激活T细胞浸润。还有比较早的研究用转染decorin cDNA的结肠癌细胞接种小鼠,与非转染癌细胞能成功接种相对,转染decorin cDNA的结肠癌细胞不能在实验动物体内形成瘤体[19]。另外,Grant等[25]通过研究发现,表达decorin基因的肿瘤细胞株接种裸鼠后,不但形成的肿瘤体积小,而且肿瘤血管再生能力也明显减弱,瘤体内血管密度降低。Reed等[26]通过另一种方式证明了decorin基因的体内抗肿瘤作用。他们先给裸鼠接种A431肺鳞状细胞癌细胞株,在接种5～12天,裸鼠出现接种的瘤体后,多次瘤体内注射decorin基因的腺病毒载体。结果移植瘤体生长减缓,瘤体与正常组织分界变清楚,并且在鳞状细胞癌的移植瘤体内出现了数个角化珠。也就是decorin基因在抑制肿瘤细胞生长的同时,还有促进细胞分化的作用。Tralhao等[27]的研究更加令人振奋,他们的结果提示decorin基因的抗肿瘤作用不限于给药肿瘤的局部,以及decorin基因的细胞生长调节作用具有选择性。随着对decorin基因及Decorin与肿瘤关系研究的深入以及对其作用机制的全面认识,它或许会在恶性肿瘤治疗中发挥重要作用。

3.3 Decorin与肌肉生长发育

Decorin是肌肉细胞外基质的重要组分。在骨骼肌分化中,他们能够结合几种细胞外基质和胞浆膜蛋白,调节肌肉的形成[28]。在早期的四肢肌肉形成过程中,观测到肌肉形成的起始与decorin表达具有时空相关性[29]。为了评价decorin在活体分化中的功能,将野生型和decorin缺失的成纤维细胞移植到鸡的肢芽上。Decorin的缺乏增加了生肌细胞的迁移,并在四肢上有更广泛的分布,这和骨骼肌分化的抑制相关,所有的表型在decorin重新表达后得到恢复[30]。MSTN,TGF-β超家族的成员,是一个胚胎期和生后的骨骼肌生长的负调节因子。它的功能是在发育的过程中维持适当的肌肉含量,并分布在成体中的骨骼肌、心脏、和脂肪组织中。无MSTN基因的纯合老鼠骨骼肌含量是野生老鼠的二到三倍[31]。近来,表面细胞质基因组共振表明DCN与MSTN之间存在互相作用[32],一种锌离子依赖的相互作用,并通过DCN核心蛋白调节。有趣的是,在试管中,固定化的DCN能够恢复MSTN对成肌细胞的增殖抑制效果,表明DCN可能束缚MSTN到细胞外基质,并调节其在成肌细胞中的活性。这种影响可能在鼠骨骼肌发育中起关键作用,因为DCN和MSTN的mRNA表达方式是相似的,并在胚胎中明显高于新生和成年的含量[33]。

3.4 Decorin在牛上的研究进展

目前,国内外对DCN基因的研究主要集中在人与鼠上,而关于牛的相关研究还比较少。牛DCN基因结构比较保守,一般由8外显子、7个内含子及其他相关DNA元件组成(GenBank登录号:NC 007303)。该基因全长约39 kb,其mRNA全长2 160 bp,编码360个氨基酸(GenBank登录号:NM 173906)。在以基因印记的方法来探索动物的生长发育过程中,Hasan Khatib[34]以牛的肝、肾、脑、肺、心脏、脑下垂体、肌肉、骨、胰腺、卵巢、羊膜、尿囊和绒毛膜等组织作为其研究对象,设计PCR引物扩增牛各组织DCN基因1041 bp的cDNA。测序结果与GenBank上公布的序列NM 173906比较,结果显示序列在 nt315和 nt648发生 A>G突变,在nt789发生C>T突变,且牛的DCN基因不具有印记特征。在探索胎牛肌肉组织形态发生过程中,Nishimura与他的同事[35]研究了DCN基因的表达和空间分布。免疫印迹分析表明,核心蛋白聚糖已经存在于2.5个月的胎牛骨骼肌组织中,且早期胚胎阶段糖胺聚糖链较晚期胚胎阶段长,但核心蛋白大小相同。在胎牛发育一个月后,mRNA开始表达,但其水平相对较低。免疫荧光显微镜检测结果显示,在胎牛骨骼肌发育过程中,核心蛋白聚糖存在于组成胶原纤维的肌束膜中,而不是骨骼肌肌内膜。现在,虽然对于牛 DCN基因研究较少,但随着对DCN基因研究的深度和广度的增加,尤其是DCN基因的功能、表达、调节以及相关性研究,将得到发展和完善。

4 Decorin在肉牛育种中的应用展望

DCN基因可作为用来寻找与抗病及生产性能相关的侯选基因。目前,功能基因的克隆测序、定位和基因多态性与生产性能的相关性分析以及分子系统进化的研究己成为动物遗传育种的热点之一。尽管国内外学者对DCN基因研究较多,特别是近年来对其在抗纤维和抗肿瘤方面的研究,但是真正对DCN基因多态性及其与生产性能的相关性研究还比较肤浅,还不能在牛的育种和生产实践中应用。在今后的研究中,应根据DCN基因的多态性来判断其基因型,并对这些不同基因型进行分析,找出各种基因型与数量性状的相关性,从而将分子生物学技术应用到动物育种实践中去。

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