玉米种子纯度室内检验方法的研究现状与应用展望

赵欣欣，于运国，崔克艳

（1.吉林农业大学农学院，吉林 长春 130118；2.吉林省辽源市龙山区工农乡政府 ）

种子纯度是影响作物产量的重要因素。研究发现，种子纯度每下降1%，就使作物产量下降1%左右。如果种子纯度不达标准，优良品种则无法发挥其高产潜力。玉米在杂交制种时，亲本种子纯度低、去雄操作不及时不彻底、其他父本花粉的杂交、种子收获及加工带来的机械混杂等多种因素都会导致种子纯度下降。做好玉米种子纯度的检验工作是控制假劣种子流入市场的重要措施。每年我国玉米新品种都大量涌现，玉米遗传资源较狭窄又致使很多品种遗传基础较为相似，这些因素都给品种纯度的检验工作带来新困难和新挑战。玉米种子纯度的室内检验是及时、快速测定种子纯度的有效方法，其中包含的各种方法各具特点，成为众多专业人士不断探索和研究的热点内容，尤其是现代检测手段的出现，为种子纯度检验带来了生机，也意味着现代种子纯度检验技术必将取代传统落后方法而开创种子纯度检验的新时代。

1 籽粒和幼苗形态特征鉴别

籽粒和幼苗形态特征鉴别是分别根据玉米种子籽粒的外部形态（如粒型、粒色、粒顶部形状及颜色及粉质多少、胚大小及形状、稃色等）和幼苗的芽鞘色的外观性状进行鉴别。这种方法虽然简单、直观，但是生产上推广的品种种类繁多，且杂交种多数与其母本自交系籽粒相同或相近，这些因素决定这种方法不适应当前的纯度检验需求。

2 以生化指纹为依据的电泳鉴别法

种子中的蛋白质是基因表达的产物，不同品种的遗传差异性则表现在它们所含有的蛋白质种类及分子量大小，因此，通过凝胶电泳技术可以将不同品种的贮藏蛋白或同工酶组分的差异性表现出来，从而对种子纯度进行测定。目前，在我国以生化指纹为依据的电泳鉴别法被种子公司所广泛采用[1]。

2.1 贮藏蛋白电泳鉴别法

目前，应用和研究最广泛的是玉米种子纯度盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定方法，这项技术在2001年已被列入我国农业行业标准（NY/T449-2001），并在2001年11月11日实施[2]。该方法因简单、经济、准确、快速的特点，被种业界广泛接受。很多研究者[3～6]对该项技术的操作技术及技巧进行了大量的探索和研究。方玉春等[7]应用该法分别对玉米杂交种和亲本自交系进行纯度检测，鉴定率为89%，同时还能有效区别单交种及其亲本。令人担忧的是，这种方法在尽显优势的同时也表现出一定的局限性，即对亲本为姊妹系、多环系、改良系等遗传基础较为复杂的杂交种、特殊单交种(亲本与杂交种谱带极相似)及正反交种却无法有效、准确鉴别[8]。可见，种子纯度室内检验需要新的更加有效的方法取而代之。

2.2 酯酶同工酶电泳鉴别法

酯酶同工酶聚丙烯酰胺电泳技术被研究者进行一定研究[12，13]，发现测定玉米种子纯度结果稳定，谱带清晰，特异性强，但由于酶的提取要求严格，且具有组织和器官特异性等特点，导致这种方法很难在生产上广泛推广和采用。

3 DNA分子标记鉴别

品种的差异性实质是品种间基因型的差别。DNA分子标记技术是通过直接分析DNA的多态性来诊断生物内在基因的排布规律及其外在性状的表现规律，通过鉴定DNA水平上的差异来鉴别品种。DNA指纹图谱技术的应用使品种纯度的检验由传统技术达到分子水平，为品种纯度鉴定提供了准确、可靠、快速、方便的方法。利用DNA分子标记技术进行种子纯度鉴定有以下特点：（1）DNA分子标记数量大，多态性水平高，可鉴定表型和电泳方法难以鉴别的品种；（2）不受时间和空间影响，即可在生长发育的任何阶段取材鉴定；（3）分离出的样品DNA可长期保存，这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。

DNA分子标记技术有三类，以杂交为基础的分子标 记 （RFLP：Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片断长度多态性)；以PCR反应为核心的DNA指纹技术 （RAPD：Randomly Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性 DNA、AFLP标记：Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性、SSR标记：Simple Sequence Repeats或 micro satellite DNA， 微 卫 星 DNA、SCAR：Sequence– related Amplified Polymorphism,序列相关扩增多态性等）；以测序为核心的新型的分子标记（SNP：Single—nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性等）。这三类标记对于种子纯度鉴定并非都适用，比如以杂交为基础的分子标记因成本过高，操作极其繁琐、复杂，很难在种子公司普及和推广；而另外两类标记则表现出较强的可行性。

3.1 以PCR反应为核心的DNA指纹技术

3.1.1 RAPD标记技术：RAPD技术操作简单、方便，只需PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，多态性高，成本较低，多位研究者[14～16]将其应用于玉米种子纯度的鉴定研究并证明了其可行性。尽管RAPD具有稳定性和重演性差的缺点，但是颜廷进[14]认为，只要每一次反应条件严格控制，就可以得到理想的重复结果。另外，林清也指出只要RAPD反应具备以下条件，就能获得理想的纯度鉴定结果：①高质量的DNA；②稳定的PCR反应条件；③稳定的程序；④适宜的引物；⑤设置重复。

3.1.2 AFLP标记技术：AFLP技术是限制性酶切、PCR和聚丙烯酰胺电泳相结合的一项技术，具有结果准确、可靠且重演性好，DNA多态性高的优点，同时克服了RFLP多态性检出率低的缺点及RAPD技术对实验条件很敏感、实验结果的重复性和可靠性较差的缺点。这种方法在玉米种质资源鉴定和类群划分上得到广泛研究[17，18]，但其缺点是操作技术较为繁琐，并要求操作者具有一定的操作技能，而且成本较高（AFLP技术是一种专利技术，受专利保护），当前使其在种子纯度的快速检测普及应用仍存在一段距离。但是，如果该方法能简化并降低成本，将成为极有推广前途的一项种子纯度检测的实用技术。

3.1.3 SSR标记技术：动、植物基因组中分布着许多由1～4个碱基对组成的简单重复序列，每个座位上重复单位的数目及重复单位序列的差异产生多态性,这种多态性远多于 RFLP的多态性，是一种较为理想的DNA标记技术，在玉米品种鉴定上进行了广泛的研究[20，21]。 吴明生[22]通过 SSR分子标记技术检测了 24份杂交玉米种子的纯度，同时将鉴定结果与田间种植鉴定结果进行比较，证实两种方法检测结果具有一致性，SSR分子标记可以替代田间种植方法进行玉米纯度鉴定。由于该标记技术具有共显性、多态性丰富、重复性强、操作简便、快速的特点，非常适于在种子公司及管理部门推广应用，因此，当前被认为是用于玉米品种纯度鉴定的最可靠且实用的分子标记技术。

3.1.4 SRAP标记技术：SRAP是在总结已有的DNA分子标记的优缺点的基础上开发的一种新型标记技术。SRAP利用引物对ORF（开放性阅读框）进行扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。这种标记技术因引物具有设计简单、结果稳定、操作简单的优点。SRAP不需要像SSR标记那样花费人力物力进行引物开发，比RAPD标记稳定；不需要像AFLP那样需要预扩增和连接，但扩增结果的多态性很丰富。SRAP标记被用于玉米自交系遗传多样性的的划分[23，24]，但在玉米种子纯度的鉴定中未见报道，由于其强大的优点在玉米种子纯度的鉴定研究将具有广泛的研究前景。

3.2 以测序为核心的新型的分子标记

SNP是指群体中基因组 DNA序列上单个核苷酸的变异。目前，基于SNP的分子标记已在人类和动物的疾病等方面进行大量研究，在植物中拟南芥、水稻[25，26]也有相关研究报道。随着玉米基因组测序的全面开展，以序列为基础SNP标记展现了巨大的利用潜力。

通过以上介绍不难看出，各种纯度测定方法各具优缺点，在实际种子纯度检测过程中应根据具体情况加以选择利用。籽粒形态鉴别法虽然较为粗糙，主观性较强，但当种子公司急于调种或村屯收种时，现场不具备检验设备，检验员可以凭借丰富的种子识别经验，作为临时方法用以鉴别种子的真实性，但之后必须采用可靠方法再进行纯度测定；但对于新育成的品种，检验员不能熟练掌握其外部特征时或对那些较难识别的品种，此种方法应慎用。

对种子纯度可靠、简便、经济、高效地进行检测一直是人们关心和追求的焦点。目前，我国大中型种子公司测定玉米种子纯度时都是以盐溶蛋白聚丙烯酰胺电泳鉴定方法为主。这种方法对少数亲本及其杂交种的区分以及遗传基础复杂的材料尚不能检验和鉴别，可考虑采用分子标记进行鉴别。因此，方法的选择应以简单、准确、经济为前提，尽管分子标记技术比生化指纹鉴别更加准确、可靠，但是相对来讲测定成本较高，因此在实际工作中可作为生化指纹鉴别的补充方法。况且，目前我国中小型种子公司并不具备分子标记测定的设备和条件，所以这项技术在推广和使用上仍然受到限制。但从我国育种工作的发展现状来看，随着科技不断进步，新技术必然替代传统技术，分子标记方法将逐渐成为蛋白质或同工酶电泳鉴定的替代方法。

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